Короновирусная инфекция у кошек лечение: Коронавирус у кошек: симптомы и лечение 

Содержание

Россельхознадзор назвал симптомы COVID-19 у домашних животных

Коронавирус SARS-CoV-2, вызывающий болезнь COVID-19, способен поражать не только человека, но и домашних животных, говорится в материале, подготовленном специалистами подведомственных Россельхознадзору ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» и ФГБУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов».

Ученые отмечают, что COVID-19 могут заражаться и самые популярные домашние питомцы — собаки и кошки. Но если собаки, как правило, переносят болезнь легко, без явных симптомов, то у кошек проявлялись признаки острой респираторной инфекции.

«В частности, у животного фиксировали повышенную температуру, кашель, чихание, истечения из носовой полости и глаз. У отдельных животных наблюдались признаки острой кишечной инфекции, сопровождавшейся рвотой и диареей», — говорится в сообщении Россельхознадзора.

Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) и Всемирной организации здравоохранения животных (МЭБ), фактов заражения людей COVID-19 от собак и кошек пока не выявлено, нет и доказательств возможности такого заражения.

Однако возможность передачи COVID-19 воздушно-капельным путем от одной кошки к другой учеными подтверждена, поэтому в Россельхознадзоре рекомендуют исключить тесные контакты между домашними животными в тех местах, где выявлено много случаев заражения коронавирусной инфекцией.

Кроме того, ведомство советует сократить контакты с домашним любимцем тем, кто сам заболел COVID-19. В частности, рекомендуется, чтобы больной человек не кормил животное и не ухаживал за ним, не гладил кошку или собаку и не давал той лизать себе руки и т.д.

Необходимости в массовом тестировании домашних животных на COVID-19 в Россельхознадзоре не видят, однако рекомендуют проверять кошек и собак, тесно контактировавших с больным либо проявляющих клинические признаки респираторного заболевания.

«Решение о тестировании животных принимается представителями государственной ветеринарной службы субъекта РФ или владельцем животного после консультации с ветеринарным врачом», — говорится в сообщении ведомства.

Для проверки животных на COVID-19 используются разработанные учеными Россельхознадзора тест-системы, выявляющие вирус методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Животное, у которого подтверждено заболевание, должно быть изолировано, ему назначается противовирусное и симптоматическое лечение вплоть до выздоровления.

Россельхознадзор — Региональные новости

© ФГУ Краснодарская МВЛ

Специалистами отдела вирусологии ПЦР, ИФА ФГБУ «Краснодарская МВЛ», методом ПЦР в исследуемой пробе фекалий был выделен генетический материал инфекционного перитонита. Проба поступила от кошки, принадлежащей частному владельцу.

Коронавирус кошек

Коронавирусы — распространенные возбудители серьезных заболеваний (зачастую со смертельным исходом) у животных. У кошек известны два основных заболевания, вызываемых этими вирусами: кошачий коронавирусный энтерит и кошачий инфекционный перитонит. Коронавирус кошачьего энтерита (feline enteric coronavirus, FECV) и вирус кошачьего инфекционного перитонита (feBneinfectious peritonitis virus, FIPV), как сейчас выясняется, представляют собой близкие штаммы одного и того же вируса. Для человека, они безвредны.

FECV поражает в основном клетки слизистой оболочки тонкого кишечника кошки и вызывают диарею (понос). Особенно восприимчивы к вирусу котята в возрасте после одного — двух месяцев. Болезнь обычно начинается с рвоты, а затем переходит в понос, который продолжается 2-4 дня, после, чего наблюдается выздоровление. Однако животные еще долго остаются носителями вируса, который выделяется с фекалиями и легко заражает других котят, если они пользуются тем же туалетом. Хотя это очень распространенное и частое заболевание котят, но не настолько опасное, чтобы привлекать к себе большое внимание.

Инфекционный перитонит (FIP) возникает неожиданно и как бы спонтанно у котят и молодых животных. В противоположность вышеописанному заболеванию, эта болезнь почти неизбежно заканчивается смертью. Вирус поражает макрофаги (белые кровяные клетки), разрушая их и тем самым открывая дорогу инфекции в тканях. Ни эффективной профилактической вакцины против этой болезни, ни лечения не существует. Чаще всего болезнь замечают по прогрессивно вздувающемуся животу, на фоне повышенной, флуктуирующей температуры тела. Это так называемая мокрая форма FIР (водянка). Но есть (значительно реже) и сухая форма, когда внешние признаки отсутствуют, а наблюдается лишь повышенная флуктуирующая температура, вялость, потеря аппетита, потеря веса. Болезнь за последние годы стала одной из самых серьезных проблем в питомниках США. Чем многочисленнее и скученнее питомник, тем больше случаев FIP. И спасти заболевших животных нельзя. Более того, нельзя поставить даже раннего диагноза, чтобы изолировать заболевшее животное; положительные иммунологические тесты на вирус могут давать и совершенно здоровые животные, если они являются носителями сравнительно безобидного FECV, который иммунологически не отличается от FIPV.

Главный практический вывод из этих наблюдений — определение средств для уменьшения риска заражения коронавирусом энтерита животных в питомнике. Некоторые из рекомендаций американских ученых и ветеринарных врачей таковы:

Причины возникновения инфекции

Как уже писалось выше, причиной коронавирусной инфекции является вирус из семейства Коронавириде (Coronaviriadea). Конкретно патогенными для кошек являются два ближайших родственника или штаммы одного и того же микроорганизма — FIPV и FECV. Первый вызывает перитонит, второй — энтерит.

В ходе научных исследования было выяснено, что FECV постоянно курсирует в кишечнике некоторых представителей кошачьих, как бы пребывая в “спящем режиме”. При определенных условиях он принимает агрессивную оболочку, вызывая либо незначительное воспаление кишечника, либо вовсе мутирует в высоковирулентный штамм FIPV.

Восприимчивость

Заболевание регистрируется у молодых кошек, не достигших двухлетнего возраста, а также у престарелых особей старше 11-12 лет. Особенно опасен коронавирус для малышей, летальность у них составляет чуть ли ни 90%, при этом не важно, какой именно штамм вызвал инфекцию.

Есть особи невосприимчивые к вирусу. Почему существует избирательность — неизвестно. Возможно срабатывает какая-то генетическая защита, блокирующая размножение возбудителя.

Во многом заболеваемость зависит от состояния здоровья, заразности штамма, а также количества, проникшего в организм вируса.

Значение имеет и иммунитет питомца: быстро выработанные антитела мгновенно захватят вирусные клетки в момент их внедрения и размножения, в результате клиническая картина не успеет развиться вовсе или болезнь проявится в легкой форме.

При слабой иммунной системе вирус быстро мигрирует из кишечника в организм, мутируя в высокопатогенный штамм со всеми вытекающими последствиями.

Что касается человека, то вирус для него абсолютно не заразен, поэтому всякие переживания по этому поводу можно смело отбросить в сторону.

Пути передачи

Основным источником заражения является больная кошка, которая выделяет вирус в окружающую среду вместе с фекалиями. Заражение здорового питомца происходит при поедании инфицированных испражнений или тесном контакте с ними, например, при скученном содержании большого количества животных в одном месте. Ситуацию усугубляют антисанитарные условия.

Шанс заболеть питомцу, проживающему в гордом одиночестве среди людей и не имеющего никакой связи с внешним кошачьим миром, сводится к минимуму. Заболевание чаще всего встречается в питомниках, где животные тесно контактируют друг с другом и находятся круглые сутки в одном помещении. По статистике у “квартирных” кошек коронавирусная инфекция встречается от пяти до пятнадцати случаев из ста, тогда как в групповой популяции эта цифра увеличивается до 60 и больше.

Существует теория передачи вируса воздушно-капельным или плацентарным путем (от матери к плоду), но каких-то конкретных доказательств или достоверных примеров этому научными умами не предоставлено.

Клиническая картина

Появление тех или иных симптомов, как уже было отмечено, зависит от степени вирулентности возбудителя.

Если вести речь о вирусном энтерите, то для него характерны признаки расстройства работы кишечника: понос, незначительная потеря аппетита, редко рвота, которые со временем проходят сами собой. Иногда могут наблюдаться простудные явления, такие как слезотечение и насморк. Затяжные поносы приводят к повышению патогенных свойств вируса и перехода кишечной формы инфекции в системное заболевание.

Инфекционный перитонит, вызванный коронавирусом, в начале процесса не имеет каких-то конкретных и ярко-выраженных симптомов. Может наблюдаться быстрая утомляемость, апатия, снижения аппетита, рвота и понос.

Со временем клиническая картина приобретает характерные черты вирусемии:

— усиливается депрессивное состояние кошки,

— снижается вес,

— слизистые оболочки бледнеют, что свидетельствует об анемии,

— появляется асцит.

По мере увеличения количества вируса в организме нарушается работа почек, печени, появляются симптомы поражения нервной системы (судороги, атония мышц и т.д.).

Диагностика

Поставить правильный диагноз можно только с помощью лабораторных исследований, которые включают в себя гистологию, ПЦР и серологические тесты. Важно правильно отобрать материал и вовремя доставить его в лабораторию.

Лечение

Специфического лечения коронавирусной инфекции кошек не существует, в этом направлении только ведутся исследования. Применение иммуномодуляторов не имеет клинического значения, антибиотики лишь временно улучшают состояние. Иногда кошки могут выздороветь спонтанно, но через время признаки вновь возвращаются.

В концепцию терапии положено снятие симптомов, а также хороший уход с качественным кормлением. Удаление асцитной жидкости значительно облегчает состояние животного на некоторое время, хотя есть шанс перехода болезни в сухую (пролиферативную) форму.

Профилактические меры

В случае коронавирусной инфекции вакцинация не работает. Да, американскими учеными создана прививка, которая в США активно применяется, но эффективность ее европейскими ветеринарами не признается. Так введение вакцины у вирусоносителей вызывает инфекционный процесс в самой тяжелой форме его проявления.

Неспецифическая мера борьбы заключается в правильном уходе, полноценном кормлении и содержании в условиях, отвечающих санитарным правилам.

Кроме того, в питомниках необходимо всеми силами предотвратить распространение инфекции среди животных, что достигается выполнением несложных мероприятий:

— нельзя пускать в группу серопозитивных животных;

— всех вновь поступающих кошек помещают на карантин, во время которого (в начале и в конце) проводят исследование крови на наличие антител к коронавирусу;

— реагирующих содержать в отдельном помещении от здоровых кошек;

— отнимать котят от матери, дающей положительные результаты в исследованиях, в раннем возрасте, что позволит избавить группу от вируса.

Коронавирус у кошек — Лечение домашних животных в Перми, в ветклинике «Друг»

Впервые коронавирус кошек был зафиксирован ветеринарами из США в 1966 году, страдают не только домашние кошки, но также и другие представители семейства (ягуары, рыси, гепарды, леопарды, манулы).
FCoV (кошачий коронавирус) – широко распространенный вирус, встречается у 25% одиночно содержащихся животных и у 75-100% группового содержания кошек, таких как питомники и приюты.
При хорошем иммунитете организм кошки самостоятельно справляется с коронавирусом. Владелец чаще не замечает энтерит, который не осложнен другими симптомами. Вирус становится опасен после своей мутации.


90% всех кошек заражены вирусом, однако только у 10% проявляется заболевание. При очень лёгком течении болезни внешне не отмечается никаких проявлений.
Коронавирусной инфекцией заражаются через фекалии, слюну и предметы обихода. Есть данные о трансплацентарной передачи инфекции, поэтому в разведение должны пускаться только здоровые животные. Котята чаще получают более высокую вирусную нагрузку, чем взрослые кошки, сталкиваясь со стрессовыми факторами (такими как вакцинация, кастрация, переезд в новый дом) и обладают незрелой иммунной системой.

Выделяют три формы коронавирусной инфекции.
Первая поражает в основном клетки слизистой оболочки тонкого кишечника кошки, вызывая диарею. Более восприимчивы котята в возрасте после одного — двух месяцев. Болезнь обычно начинается с рвоты, а затем переходит в понос, который продолжается 2-4дня, после чего наблюдается выздоровление, но животные еще долго остаются носителями вируса, который выделяется с фекалиями и легко заражает других котят. Данная форма не представляет угрозы для питомца. Две другие формы это уже мутация коронавируса — инфекционный перитонит (FIP), которая возникает неожиданно (спонтанно) у котят и молодых животных. Эти формы почти неизбежно заканчивается смертью. Инкубационный период, предшествующий развитию FIP, может длиться от нескольких месяцев до нескольких лет. FIP – чрезвычайно тяжелое заболевание, которое развивается в результате действия комплекса факторов (стресс, чистопородность, групповое содержание, риск развития FIP повышается у кошек, инфицированных FeLV (ВЛК) или FIV (ВИК).
Сухая форма, которая развивается медленно и постепенно переходит в хроническое состояние. Тяжёлая (или влажная) форма гораздо опаснее, так как происходит стремительное размножение вируса. При таком течении болезни в брюшной полости скапливается жидкость и развивается выпотный перитонит, а также может наблюдаться выпот в плевральной полости, одышка, иктеричность и бледность слизистых оболочек. Клинические признаки FIP на ранней стадии можно спутать с другими распространенными инфекционными заболеваниями такими как панлейкопения, респираторные инфекции, токсоплазмоз, лейкоз, иммунодефицит, лимфома, аденокарцинома). При сухой форме часто встречаются офтальмологические (увеит, ирит, преципитаты на роговице) и неврологические нарушения, а также проявляется хроническим гранулематозом органов и систем.
По мнению многих авторов, выпотный и сухой перитонит не являются взаимоисключающими формами и нередко переходят одна в другую. Примерно у 10% кошек с выпотной форме отмечается патология глаз и центральной нервной системы. Кроме того, известны случаи, когда на фоне ремиссии выпотного перитонита развивался сухая форма.

На данный момент наиболее точно диагностировать FIP можно с помощью иммуногистохимического анализа. Однако для проведения указанных исследований требуются образцы тканей, взятые методом биопсии в ходе хирургической операции или при вскрытии. Таким образом, неинвазивные методы для постановки диагноза при жизни животного недоступны. Прижизненный диагноз носит предположительный характер и ставится на основании клинических признаков, результатов общего клинического и биохимического исследований крови и анализа выпотной жидкости.
Исследование выпотной жидкости является наиболее точным методом прижизненной диагностики FIP.
ПЦР крови и кала помогает установить присутствие РНК вируса. Но данный анализ часто дает ложноположительный или ложноотрицательный результат. Поэтому его повторяют три раза на протяжении 14 дней. Если ответ отрицательный, то можно с уверенностью сказать, что в организме кошки нет микрофлоры, содержащей коронавирус.

Коронавирус кошек не опасен для человека, так как является специфической структурой, которая активируется только в кошачьем организме. Даже при попадании мутированных форм коронавируса в человеческий организм, иммунная система справляется с чужеродными частицами и инактивирует их. Но человек может быть потенциальным разносчиком вируса. Поэтому соблюдение правил гигиены в доме является обязательным условием содержания кошки. Коронавирус крайне не устойчив во внешней среде, легко инактивируется большинством дезинфицирующих средств. Но вирус довольно устойчив к низким температурам.
Лечение
Эффективного лечения вирусного перитонита нет. В настоящее время активно ведутся исследования, посвященные методам лечения FIP
В основном лечение направлено на сопутствующие проявления болезни – гепатонефропатия, поражения лёгких и сердца, нервные проявления. Ветеринарный врач сам выбирает тактику лечения.

 

  •  

Коронавирусная инфекция (коронавирус) у кошек – симптомы, диагностика, лечение

Коронавирус кошек – это вирусное заболевание, которое может проявляться двумя типами: кишечный коронавирус (или FECV) и вирусный (инфекционный) перитонит (или FIP).

Содержание
  1. Пути передачи инфекции
  2. Клинические признаки
  3. Диагностика
  4. Лечение
  5. Вакцинация

Этот вирус наименее изучен среди других и может вызывать неизлечимое заболевание у довольно молодых животных. Знать тип навируса у заболевшего животного очень важно для определения того, насколько угрожающей жизни будет инфекция. Кишечный коронавирус, как правило, протекает довольно легко, иногда с минимальным количеством клинических признаков или вообще без таковых. Однако FECV имеет вполне реальную возможность преобразования в инфекционный перитонит, что крайне опасно и, как правило, смертельно.

Пути передачи инфекции

Коронавирус очень часто возникает у непривитых животных и у тех, которые живут в приютах и находятся в тесном контакте с другими кошками. Инфекционный перитонит является довольно редким заболеванием и возникает только примерно у одного процента всей популяции кошек. Однако в последнее время мы все чаще встречаем животных, пораженных данным типом вируса. Кишечный коронавирус является гораздо более распространенным. Несмотря на то, что такая форма совсем не опасна сам по себе, но сам факт того, что вирус может мутировать в вирус инфекционного перитонита, делает его более опасным.
Оба вида коронавирусной инфекции у кошек имеют только один способ передачи – через слюну. Поэтому он так высоко распространен среди кошек, живущих в приютах, где для них нет разделения мисок с едой и водой, а также имеет место постоянный контакт и возможность легкого обмена жидкостями организма.

Клинические признаки

При проявлении кишечного коронавируса у кошек симптомы обычно выражены незначительно и, скорее всего, не будут сильно беспокоить животное. Наиболее распространенной жалобой для этого штамма вируса является умеренная диарея. Если организм животного в состоянии бороться с FECV, то скорее всего не будет никакого серьезного вреда, и он никак не скажется на нормальной жизни животного.
Однако, если организм животного ослаблен и не в состоянии бороться с кишечным коронавирусом, он мутирует в вирус перитонита, и тогда наиболее вероятно, что животное рано или поздно умрет от инфекции. Симптомы FIP гораздо более очевидны и могут включать в себя:

  • чрезмерную диарею
  • усталость и слабость
  • одышку
  • внезапную необъяснимую потерю веса
  • снижение аппетита

Также существует 2 типа инфекционного перитонита: сухой и выпотной. При втором типе в брюшной полости животного скапливается вязкая жидкость. В таком случае мы можем видеть увеличенный в объеме живот в низкой или высокой степени.

Диагностика

Коронавирус у кошек может быть легко обнаружен по результатам анализов крови. Тестирование крови определяет, вырабатывает ли иммунная системы защитные клетки (антитела) к коронавирусу. К сожалению, ни один анализ не способен различать FECV и FIP. Таким образом, только проявляющиеся симптомы, могут сказать, произошла ли мутация вируса. Наиболее достоверным является подтверждение диагноза путем анализа выпота, собранного из брюшной полости, на наличие в ней инфекции.

Лечение

К сожалению, в настоящее время нет ни одного способа лечения коронавируса у кошек, ни штамма, вызывающего FECV, ни штамма, вызывающего FIP. Как только у животного диагностирована эта инфекция, это необратимо и она останется с ним на всю жизнь.

В большинстве случаев кишечный коронавирус не преобразуется в инфекционный перитонит. Но если это все же произошло, нет никакого другого лечения кроме симптоматического для продления жизни животного на неопределенное время – капельные инфузии, устранение боли, откачивание жидкости из брюшной полости, накопление которой проявляется в большинстве случаев инфекционного перитонита.

Вакцинация

Существует вакцина от коронавируса, но достоверно неизвестно, является ли она полностью эффективной для предотвращения передачи заболевания. Аналогичным образом было доказано, что вакцина повышает вероятность возникновения FIP, когда животное уже заражено вирусом.

Статья подготовлена врачами терапевтического отделения «МЕДВЕТ»
© 2014 СВЦ «МЕДВЕТ»

Коронавирус у кошек — симптомы, лечение коронавирусного энтерита кошек в Москве . Ветеринарная клиника «Зоостатус»


Передача вируса
Штаммы коронавируса. Вирусный перитонит кошек
Симптомы коронавирусного энтерита
Вакцинация
Диагностика коронавируса кошек
Профилактика коронавирусной инфекции
Элиминация вируса

Кошачий коронавирус (FCoV) относится к семейству Coronaviridae и широко распространен в популяции домашних кошек.

Наиболее часто коронавирусным энтеритом заражаются животные, содержащиеся большими группами (в питомниках или при групповом содержании). Заражение происходит фекально-оральным путем, чаще всего источником вируса для котят становится их мать.

Коронавирус кошек в большом количестве (миллиарды вирусных частиц на 1 грамм кала) выделяется с фекалиями инфицированных кошек. Заражение коронавирусом происходит, когда кошки глотают или вдыхают вирус. Вирулентность (заразность) данного вируса высокая, для распространения достаточно небольшой частицы наполнителя из кошачьего лотка, который ранее использовала инфицированная кошка. По разным исследованиям от 60 до 80% всей популяции кошек заражены коронавирусом или когда-либо контактировали с ним.

Кошачий коронавирус относительно стабилен и во внешней среде может оставаться жизнеспособным в течение 7 недель.

Вирус проникает в организм через ротоглотку, и в первую очередь поражает клетки эпителия желудочно-кишечного тракта (тонкого кишечника). Иммунная система кошки работает над выведением вируса, и большинство животных побеждают инфекцию, что приводит к элиминации (выведению) вируса из организма. Процесс естественной элиминации коронавируса может занимать от нескольких недель до нескольких месяцев.

Кошачий коронавирус почти никогда не проникает через плаценту к будущему котенку. Большинство котят получают инфекцию после того, как уровень защитных антител в молоке угас, т.е. как правило в возрасте 5-7 недель.

Риск опосредованной передачи (через одежду, руки владельцев, животных другого вида) невелик, такая передача возможна только при непосредственном загрязнении одежды или обуви фекалиями инфицированной кошки.

Принято разделять два штамма вируса – собственно «кишечный» коронавирус кошек (FCoV) и вирус инфекционного перитонита кошек (FIPV). Эти вирусы чрезвычайно близки по антигенному составу, причем FIPV представляет собой мутантную форму кишечного вируса (изменение происходит в организме животного-носителя под воздействием стресс-факторов).

Кишечная форма коронавирусного энтерита (FCoV) обычно протекает достаточно легко и не является заболеванием, угрожающим жизни, в то время системная форма – инфекционный перитонит является тяжелым 100% летальным состоянием.

Очень важно понимать, что хотя заболевание коронавирусным энтеритом и инфекционным перитонитом имеют одного и того же возбудителя, это принципиально разные, ни в коем случае не тождественные заболевания. Кошка с кишечным коронавирусом может никогда не заболеть вирусным перитонитом, а кошка с FIP может не выделять вирус из кишечника с фекалиями.

Вирус инфекционного перитонита кошек FIPV – продукт мутации штамма кишечного коронавируса. FCoV имеет тропность к эпителиальным клеткам кишечника и размножается только в них, в то время как после мутации вирус поражает макрофаги (клетки лейкоцитарной системы, основная функция которых – поглощение чужеродных клеток) и с током крови распространяется по всему организму, таким образом поражая все системы органов.

Важно! Коронавирус не равен FIP! Если у вашей кошки обнаружили коронавирус – это еще не значит, что она больна. Достоверного теста на FIP не существует, все современные методы исследования позволяют определить только сам коронавирус или антитела к нему.

Заразность кишечной формы коронавируса крайне высока, при этом вероятность спровоцировать заболевание вирусным перитонитом кошек, напротив, мала – вирусный перитонит кошек развивается менее чем у 10% кошек, инфицированных коронавирусом.

В зоне риска находятся животные до года, а также содержащиеся в неудовлетворительных условиях, испытывающие воздействия стресса или других иммуносупрессивных состояний.

При контакте кошки с коронавирусом существуют 4 варианта развития событий:

  • У животного разовьется FIP (как было сказано выше, это менее 10% зараженных животных).
  • Кошка некоторое время будет выделять вирус, вырабатывает антитела, затем прекращает выделять вирус, и титр антител снижается вплоть до нуля. Примерно в половине всех случаев заражения выделение вируса длится в пределах месяца, и только 5% кошек выделяют вирус более 9 месяцев.
  • Кошка становится носителем FCoV пожизненно (13% всех инфицированных кошек). Такие кошки постоянно выделяют FCoV в фекалиях, и он может быть обнаружен. Большинство пожизненных носителей остаются клинически здоровыми, однако у некоторых проявляется хроническая диарея.
  • Кошка устойчива к вирусу – представляется, что около 4% кошек из всей популяции абсолютно устойчивы к коронавирусной инфекции, они никогда не выделяют вирус во внешнюю среду, у них вырабатывается иммунный ответ, который практически невозможно обнаружить, т.к. титр антител имеет предельно низкие значения.

Коронавирусная инфекция у кошек чаще всего протекает без каких-либо жалоб, либо проявляется умеренно выраженными симптомами, связанными с воспалительным процессом в тонком кишечнике (коронавирусный энтерит) вследствие разрушения слизистой оболочки кишечника.

Проявления короновирусного энтерита у кошек:

Как правило, эти симптомы не вызывают серьезного ухудшения общего состояния и не требуют медикаментозного лечения, если речь не идет о присоединении вторичной инфекции или сопутствующих заболеваниях.

Попыток разработать эффективную и безопасную вакцину от FIP было предпринято множество, однако большинство из них были неудачными. На сегодняшний день на рынке представлена интраназальная вакцина от коронавируса кошек Primucell, Pfizer.

Вакцина изготовлена на основе температурно-зависимого штамма коронавируса, этот штамм способен к репликации (размножению) только в ротоглотке, где более низкая температура, поэтому он вызывает местный иммунитет в воротах вхождения вируса, но продуцирует очень маленькое количество системных антител.

Данная вакцина эффективна против коронавируса и удовлетворяет требованиям безопасности, однако не получено убедительных доказательств в пользу ее эффективности от инфекционного перитонита, вызываемого коронавирусом. Кроме того, к моменту достижения возраста 16 недель (рекомендуемый срок первичной вакцинации) большинство кошек группы риска уже серопозитивны (имели контакт с коронавирусом), а значит вакцинация не имеет смысла.

Кишечный коронавирус не является тяжелым заболеванием, поэтому вакцинация от него применяется редко, эффективность же от FIP требует дальнейших исследований. На 2014 год данная вакцина не включена в список рекомендуемых комитетом по вакцинации Всемирной ассоциации врачей по мелким домашним животным (WSAVA).

Коронавирус довольно непрост в диагностике, что связано с тем, что абсолютное большинство кошек являются бессимптомными носителями или выделяют вирус в течение значительного промежутка времени.

FCoV выделяется со стулом, поэтому наиболее чувствителен тест на определение вируса в фекалиях. Очень редко коронавирус выделяется со слюной, как правило, это происходит на начальном этапе заражения.

Однократное исследование фекалий методом ПЦР малоинформативно: если кошка выделяет вирус время от времени, то она может как быть выделяющим вирус носителем, так и не выделять в течение короткого промежутка времени.

ПЦР-тест должен быть частью серии исследований, лучше всего делать его в сочетании с иммунофлюоресцентными анализами на антитела.

Существуют разные мнения, насчет того, как достоверно установить факт элиминации коронавируса (избавления кошки от инфекции) – как правило, для этого требуется выполнение 5 последовательных исследований фекалий методом ПЦР с интервалом в 4 недели, и получить все результаты негативными. Согласно шведскому институту вирусологии, кошка считается не выделяющей коронавирус, если будут отрицательными 4 исследования фекалий методом ПЦР, сданные один за одним с промежутком 7-10 дней.

В любом случае кошка, не выделяющая вирус по результатам серии тестов, не опасна для других животных ни в содержании, ни в разведении и не не заражает других кошек контактным, половым и вертикальным (через размножение) путем.

Уменьшение титра антител до уровная <10 также указывает на элиминацию вируса, но обычно снижение титра антител наблюдается уже после того, как кошка перестала выделять вирус.

Для того, чтобы установить, что кошка является пожизненным носителем коронавируса, результаты анализов кала на FCoV должны оставаться положительными в течение как минимум восьми месяцев.

В группах кошек, у которых не отмечается инфицирования коронавирусом, необходимо обследовать всех новых подселяемых кошек, и не вводить в прайд серопозитивных животных.

Желательно, чтобы вновь поступившие кошки прибывали из питомников, где все животные тестируются на FCoV и серонегативны. Карантин в отдельном помещении с отдельным лотком должен составлять 12 недель, после чего проводится повторный тест. Только кошки с нулевым титром антител должны быть допущены в питомники, свободные от FCoV.

Инфекция FCoV может быть естественным образом элиминирована из питомника, где обитает менее 10 животных, в то время, как если в одном помещении контактируют более 10 животных, спонтанное естественное выведение вируса очень маловероятно, так как происходит постоянная перекрестная передача от одной кошки к другой. В таких группах кошек необходимо провести тестирование, изолировать кошек с котятами на 12 недель. Ранний отъем (до 4 недель) и удаление котят на 12 недель от серопозитивных матерей способствует искоренению инфекции. Все кошки, дающие положительную реакцию, должны быть удалены, хотя это и не дает полной гарантии быстрого избавления от вируса, так как бессимптомные носители могут быть серонегативными.

Если кошки содержатся в доме, необходимо обеспечить индивидуальный лоток для каждой кошки, в идеале – в разных комнатах. Лотки должны содержаться в чистоте, необходимо избегать остатков высохших фекалий, которые становятся летучими. Предпочтительно использовать закрытые лотки-домики и непылящий комкующийся наполнитель, чтобы минимизовать распространение микрочастиц фекалий.

Миски с кормом должны стоять как можно дальше от лотков с наполнителем.

Если вы потеряли котенка вследствие FIP, выждите не менее месяца, прежде чем приобретать нового питомца.

Вопросом скорейшей элиминации коронавируса у кошек озабочены многие владельцы кошек и питомников. В интернете можно встретить самые фантастические многоступенчатые схемы выведения вируса, содержащие рекомендации по диете, курсам иммуномодуляторов из нескольких препаратов, витаминов, антиоксидантов, гомеопатических средств и т.п. Как правило, авторы этих схем имеют отдаленное отношение к ветеринарии и еще более отдаленное – к принципам доказательной медицины.

Если речь не идет о бесконтрольном использовании набора иммуностимулирующих препаратов, любые действия владельца, направленные на “элиминацию” не нанесут вреда животному, но едва ли повлияют на вирус. Необходимо понимать, что рано или поздно абсолютное большинство кошек самостоятельно элиминирует вирус (в противном случае, смертность от вируса была бы очень высокой), а кошки, которые сначала показывали носительство (без клинических признаков болезни), а после перестали показывать вирус в анализах, практически не заболевают FIP, точнее их риск заболеть вирусным перитонитом равен риску по популяции кошек в целом.

Важно! Безобидный коронавирус мутирует в летальный FIP при стрессе. Чем меньше стресса, чем меньше населенность кошачьей популяции – тем больше шансов что при инфицированности коронавирусом FIP не выработается. Чем больше владельцы начинают экспериментировать, «лечить» и «элиминировать» вирус, особенно если это связано с принудительным введением каких-либо препаратов – тем больше стресса они вызывают у животного и тем самым повышают вероятность развития FIP.

Для кошек – носителей коронавируса наибольшая вероятность развития FIP существует в возрасте до года, поэтому если у вашей кошки антитела к FCoV обнаруживаются в более позднем возрасте, маловероятно, что у нее возникнет FIP.

Меры, которые могут способствовать элиминации или по крайней мере бессимптомному перенесению коронавируса:

  • Хороший уход, поддержание высокого уровня гигиены;
  • Полноценное разнообразное кормление высокобелковым кормом. Существует мнение, что закисление среды желудочно-кишечного тракта, что достигается, прежде всего, высокой долей термически необработанных мясных продуктов в рационе, может способствовать элиминации коронавируса, однако это не подтверждается никакими объемными исследованиями, кроме того, кормление сырым рационом закономерно повышает риск гельминтозов, токсоплазмоза и т.д.;
  • Антиоксиданты, такие как витамины A, C и E и цинк, возможно, оказывают противовирусное и/или иммуностимулирующее действие. Все витаминные препараты имеет смысл применять относительно короткими курсами и под контролем ветеринарного врача. Витамин А у кошек плохо усваивается из растительной пищи, но источником этого витамина может быть печень или рыба (палтус, треска). Витамин A не должен применяться дольше 6 недель, т.к. существует риск избыточного накопления в костной ткани. Витамины C и E можно давать кошке на протяжении более длительного времени, однако необходимо контролировать pH мочи, который может закисляться от примения аскорбиновой кислоты, что приводит к циститу и отложению кристаллов оксалата кальция. Нет необходимости продолжать использовать антиоксиданты дольше, чем несколько месяцев после того, как у кошки был риск заражения коронавирусом FCoV, более того, это может быть вредно.

Лечение особо опасных вирусных инфекций животных

Инфекционные болезни занимают особое место среди всех патологий животных. В мире известно более 20 особо опасных болезней животных. Рассмотрим ниже часть из них. Болезни, которые поражают домашних любимцев.

Кошки

Лейкемия кошек

Это заболевание, поражающее кровеносную и лимфатическую системы.

Возбудителем является вирус семейства Retroviridae, подсемейства Oncornavirinae. Вирусный лейкоз кошек опасен для всех пород. Заражение происходит при контакте через слизистые оболочки, органы ЖКТ, кровь, плаценту инфицированной матери, а также во время грудного вскармливания.

В некоторых случаях данный вирус не проявляет себя годами. Существует 3 вида штаммов вируса лейкемии кошек:

  • угроза иммунной системы
  • развитие опухолей
  • вызывает анемию

Симптомы: Бледные слизистые оболочки, увеличение лимфатических узлов, постоянные респираторные заболевания, понос, рвота, слабость вялость, стоматит.

Лейкемию сложно диагностировать на ранних стадиях. Для диагностики используются лабораторные исследования крови: иммуноферментный анализ (ИФА), ПЦР диагностика. Для наиболее точного результата нужно использовать оба варианта диагностики так как возможен ложноотрицательный результат.

Вирус Лейкемии является вредоносным. Как только животное заражается, оно сразу становится заразным и требует изоляции.

В настоящее время лечения от лейкемии не существуют, поэтому очень важно проводить профилактические мероприятия: 

  •  вакцинация животных,
  •  ежегодная сдача анализов крови,
  •  осмотр и консультация ветеринарного специалиста.

Вакцинируются только животные, проверенные на отсутствие лейкоза методом ИФА и ПЦР минимум 2-3 раза с интервалом 3-4 недели. Вакцинация не дает 100% гарантии, поэтому лучше избегать контакта с потенциальными носителями.

Вирусный иммунодефицит у кошек

Вирус поражает лимфатическую систему кошек, вызывая синдром иммунодефицита. Постепенно развиваясь, он может приводить к развитию новых инфекций, заболеваний различных органов и злокачественных образований.

Заражение происходит при контакте с больным животным, через укусы или при половом акте.

Для диагностики используются иммуноферментный тест (ИФА) или полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Лечение, в основном, симптоматическое. Направлено на поддержание иммунной системы и улучшение качества жизни животного. 

Коронавирус у кошек

Инфекционное заболевание. Возбудителем является Feline Coronavirus (FCoV).  Вирус поражает в основном ЖКТ животного. Осложнения, вызванные данным вирусом, могут быть смертельными. Такими осложнениями являются инфекционный перитонит и инфекционный гастроэнтерит.

Вирусу особенно подвержены молодые животные. Первым признаком поражения является рвота. Затем начинается диарея, которая длится до 4 дней. Важно провести своевременную диагностику, особенно непривитого животного. 

Даже после выздоровления животное является носителем вирусом, а значит, может заразить других кошек.

Источник коронавируса — фекалии зараженных животных, игрушки и предметы ухода и уборки.

Для профилактики рекомендуем провести вакцинацию и избегать контактов с незнакомыми животными. Важно сдавать анализы крови на наличие антител к данному вирусу.

Панлейкопения (кошачья «чумка»)

Это заболевание вызывается парвовирусом. Характеризуется лихорадкой, поражением сердца, ЖКТ (желудочно-кишечного тракта)

Ему более подвержены особи до года. У заболевания есть 3 вида развития:

  1. Молниеносная. Развитие и угасание животного происходит за 1-2 дня.

  2. Острая. Первые симптомы заметны на 2-й день и, если вовремя принять меры, питомца можно вылечить.

  3. Подострая. Иногда проявляется у привитых кошек. При своевременном лечении кошка выздоравливает.

Симптомы: Повышение температуры, животное вялое, прячется в темном углу.

Специального лекарства от заболевания нет. Лечение назначается каждому питомцу индивидуально. Единственными профилактическими мерами являются своевременная сдача анализов и вакцинация по возрасту.

Собаки

Аденовироз

Вирусное заболевание с симптомами поражения респираторного и желудочно-кишечного тракта. Болеют собаки всех возрастов.  

Основной источник инфекции — больные собаки, выделяющие вирус с мочой, калом, носовой слизью и конъюнктивальным секретом. Заражение может происходить не только через слизистые оболочки носовой и ротовой полостей, но и половым путем.

Симптомы при аденовирозе: вялость, покраснение слизистой глотки, выделения из носа, сухой кашель, хрипы в легких, может быть понос, рвота, снижение аппетита. В кале остатки непереваренного корма. 

Симптомы аденовироза схожи с симптомами чумы, поэтому рекомендуем показать животное врачу в течение суток.

Профилактика: вакцинация.

Чума плотоядных

Острое вирусное заболевание с поражением органов дыхания, пищеварения, кожи, нервной системы. Чаще болеют собаки от 2 до 3 лет. Передается контактным и воздушно-капельным путями. 

Во внешней среде вирус крайне неустойчив. Относительно устойчивы к заболеванию дворняжки, терьеры и боксеры. Наименее устойчивы собаки культурных и декоративных пород. Смертность составляет около 50%. 

Заражение происходит воздушно-капельным путем. Инкубационный период от 2 дней до 2-3 недель, а само заболевание может носить острый, сверхострый и даже молниеносный характер, при котором собаки могут погибнуть внезапно, без проявления клинических признаков.

При сверхостром течении болезнь продолжается 2-3 дня, температура резко повышается. Животное отказывается от пищи, наступает коматозное состояние, и собака погибает. При остром течении болезнь длится 2-4 недели.

Различают катаральную (легочную), кишечную и нервную формы заболевания

Для диагностики применяют иммуноферментный анализ (ИФА) и сверхчувствительный метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Симптомы: 

  • Температура 40-41.
  • Через несколько недель: вялость, отказ от пищи, покраснение роговицы глаз и возможны гнойные выделения; возможны понос и рвота.
  • Затрудненное дыхание, кашель, в каловых массах можно заметить прожилки или сгустки крови.
  • При нервной форме — судорожность конечностей, и нижней челюсти, поскуливание. Возможен полный паралич (обычно при длительном течении болезни). 

У выздоровевших от чумы собак инфекция может через несколько лет привести к «энцефалиту пожилых собак».

Профилактика: Вакцинация животных по возрасту.

Бешенство

Является одним из самых опасных заболевний для животных.

Острая вирусная инфекция, одинаково опасная как для животных, так и для людей. Характеризуется поражением ЦНС, передается через укусы зараженных животных. Инкубационный период от нескольких суток до нескольких месяцев. 

Первые признаки — беспокойство, раздражительность, угнетенное состояние, светобоязнь, боязнь воды, усиление слюноотделения.

Болезнь продолжается 8-11 суток. В особо серьезных случаях смерть может наступить на 3 сутки.

Лекарства от бешенства не существует и единственный способ профилактики- ежегодная вакцинация.

Уважаемые владельцы, не забывайте, что болезнь лучше предотвратить, чем заниматься долгим и затратным лечением.
Ежегодная диспансеризация и вакцинация по возрасту, существенно снизят риск заболевания Вашего животного, повысят его шансы жить долго и счастливо, а Вам добавят покоя и оградят Вас от лишних серьезных трат на лечение любимого питомца

Могут ли домашние животные заразиться коронавирусом?


С начала 2020 года пандемия коронавирусной инфекции достигла планетарных масштабов. Нависшая проблема не обошла стороной и наших домашних животных. Грозит ли кошкам и собакам Covid-19? Передается ли заболевание от животных к человеку? Разберём подробно эти и другие актуальные вопросы.

Коронавирус у домашних животных

Covid-19

Подозрения на вирус у животных начались с истории про померанского шпица, жившего в Гонконге. Собаку изолировали, а через несколько дней она погибла. Но шпицу было 17 лет — при максимальной продолжительности жизни 15 лет. При выявлении подозрительного вируса у шпица врачи подчеркнули, что животное не являлось переносчиком, потому заразить человека не могло.

Другой случай, вызвавший опасение хозяев, связан с немецкой овчаркой, у которой также подозревали коронавирус. Никаких патологических симптомов у животного не оказалось, а окружающие собаки, контактировавшие с овчаркой не были заражены. 

Поэтому говорить об инфекции Covid-19 у животных нет смысла. Вывод напрашивается сам собой:

Подтверждённых исследований о том, что домашние животные могут быть переносчиком опасного вируса Covid-19 и заразить окружающих людей — нет.


FCoV

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) дает официальную оценку происходящего. На сегодняшний момент случаи обнаружения Covid-19 у собак и кошек не зафиксированы. Это означает, что вероятности инфицировать человека или, наоборот, заразиться от хозяина практически нет. 

Больше половины представителей вида кошек – носители другого вируса: Feline Coronavirus, FCoV. Бессимптомные носители – инфицированные животные, являют собой угрозу для окружающих животных. При этом сами не болеют.



Пути передачи FCoV:

  • Алиментарный – через пищу, испражнения.
  • Вертикальный – от беременного животного к потомству.
  • Половой – во время вязки с носителем инфекции.

Состояние может протекать длительное время бессимптомно. Заболевание сопровождается ярко выраженной клинической картиной только при наличии провоцирующих факторов. Животные обычно заболевают на фоне сопутствующей хронической патологии, сниженных ресурсов иммунной системы. В основную группу риска входят щенки и котята до 6 месяцев, а также питомцы преклонного возраста.


Основная симптоматика, возникающая у собак и кошек:

  • Рвота и понос с примесями крови (признаки гастроэнтерита).
  • Вялость и апатичное поведение.
  • Повышение температуры выше 39 градусов.
  • Отсутствие аппетита, снижение веса.

Не всегда проявления энтерита и гастроэнтерита является следствием инфекции. Иногда расстройство желудка (понос, рвота) или снижение аппетита возникают на фоне неправильного питания. 

Ещё на тему: Диета для собак, Почему кошка не ест?



Инфекционный перитонит

Наиболее тяжелой формой является инфекционный перитонит кошек (FIP/ИПК). Болезнь – следствие мутации FCoV. Далее вирус распространяется в клетки крови, поражая сосудистую сеть и выводя белок из организма. Различают экссудативный (влажный) и сухой варианты перитонита. Начальные стадии могут проявляться легким энтеритом (периодическое несварение желудка). В дальнейшем ситуация осложняется появлением следующих симптомов:

  • Наличие жидкости в брюшной полости (асцит), мозговых оболочках (гидроцефалия).
  • Поражение центральной нервной системы.
  • Нарушение дыхания (одышка, удушье).
  • Увеличение лимфоузлов.
  • Появление гнойных гранулем в органах желудочно-кишечного тракта (характерно для сухой формы болезни).
  • Офтальмологические проблемы (нистагм – наблюдается при сухом перитоните).
  • Анорексия (истощение).
  • Лихорадка (температура выше 40 градусов).

Важно! Практически в 100% случаях инфекционный перитонит ведёт к гибели домашнего животного.



Диагностика

Выявить тот или иной вирус позволяют специальные методы исследования:

  1. Общий клинический анализ крови.
  2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – позволяет обнаружить фрагменты ДНК в ректальных смывах или в клиническом анализе крови.
  3. Иммуноферментный анализ (ИФА) – определение антител и антигенов специфических инфекций в биохимическом анализе крови. Считается более информативной методикой, так как позволяет точно установить количество вирусных клеток в единице исследуемого материала.
  4. Электрофорез белков.
  5. Ультразвуковое исследование брюшной полости.
  6. Цитологическое исследование выпотной жидкости (экссудат, транссудат).

Для анализа также используют полостную жидкость (из брюшины, плевры, перикарда), которая скапливается при перитоните. Подобное исследование помогает провести дифференциальную диагностику между коронавирусом, онкологией и иммунодефицитом.



Лечение и профилактика FCoV  

Специфического лечения не существует — антивирусные препараты не дают должного эффекта. Обнаруженный у носителя вирус требует постоянного наблюдения: пару раз в год необходимо сдавать анализы и контролировать уровень антител в сыворотке крови.

Во время обострения ветеринарные специалисты назначают антибактериальную, гормональную терапию. Для укрепления жизненных ресурсов организма рекомендуют иммуностимуляторы. Поддерживающее лечение длится от двух до трех недель, после чего делается контрольный анализ на определение титра.

Обезопасить своего питомца в условиях карантина вполне возможно. Особенно эта информация актуальна для «собачников», ведь ежедневные прогулки никто не отменял.

Рекомендации специалистов для безопасного выгула собак:

  1. Контролируйте гигиену домашних любимцев: тщательно обрабатывайте лапы с применением моющих средств и проточной воды.
  2. Держите дистанцию. Скопление людей провоцирует распространение вируса. Сильному и здоровому животному ничего не угрожает, но при слабом иммунитете вероятность заболеть достаточно высокая.
  3. Не игнорируйте вакцинацию и другие профилактические меры, предлагаемые ветеринарией.
  4. При малейших подозрениях на вирусную инфекцию, обратитесь за помощью к лечащему ветеринару. Следуйте его рекомендациям.


Выводы

Эпидемия коронавируса набирает обороты, но паниковать не стоит. Соблюдая элементарные меры профилактики, можно без труда сохранить жизнь, здоровье семьи и своего питомца. 

Подводя итоги, напомним, что подтверждённых исследований о том, что домашние животные могут быть переносчиком опасного вируса Covid-19 и заразить окружающих людей — нет. 

Но не забывайте предпринимать меры предосторожности от других вирусных инфекций. Следите за здоровьем питомца и вовремя обращайтесь к ветеринарному специалисту.

Ещё на тему: Какие заболевания переносят клещи и блохи?, Гельминты у кошек и собак.

Оставайтесь дома и пользуйтесь заказом товаров для животных с бесконтактной доставкой!

Рекомендуем также

границ | Возможная противовирусная активность 5-аминолевулиновой кислоты при инфекции, вызванной вирусом инфекционного перитонита кошек (коронавирус кошек)

Введение

Инфекционный перитонит кошек (FIP) — опасное для жизни инфекционное заболевание, вызываемое коронавирусом кошек (FCoV) у домашних и диких видов Felidae. FCoV широко распространен среди кошек во всем мире. FCoV представляет собой оболочечный однонитевой вирус с положительной смысловой РНК. Этот вирус принадлежит к роду Alphacoronavirus подсемейства Orthocoronavirinae семейства Coronaviridae (1).FCoV делится на два серотипа на основе аминокислотной последовательности белка spike (S), серотипа I FCoV и серотипа II FCoV (2). Серологические и генетические исследования показали, что FCoV типа I преобладает во всем мире (3–5). FCoV в основном передается фекально-оральным путем (6). Большинство кошек, инфицированных FCoV, имеют субклинический характер. Однако в S-белке произошло несколько мутаций, которые привели к развитию вирулентного типа, называемого вирусом инфекционного перитонита кошек (FIPV) (7, 8). Отличительными патологическими признаками FIP у кошек являются серозная жидкость в брюшной и плевральной полостях и пиогранулематозные поражения в некоторых органах (9).

FIP — это иммуноопосредованная вирусная инфекция, которую трудно лечить. Недавно было сообщено о нескольких эффективных противовирусных препаратах для лечения FIP (10, 11), но многие из них недоступны для практического использования. Некоторые препараты против FCoV, такие как итраконазол, доступны в больницах для животных, но их лечебный эффект ограничен (12). Поскольку FIP является хроническим и системным заболеванием, достичь клинической ремиссии сложно. Соответственно, желательно, чтобы терапевтические препараты от FIP имели следующие характеристики: (1) небольшое количество побочных эффектов для кошек, (2) низкая цена и (3) низкий мутагенез патогенов.

5-аминолевулиновая кислота (5-ALA) — это низкомолекулярная аминокислота, синтезируемая в клетках растений и животных (13, 14). Это промежуточный продукт в биосинтезе тетрапиррола. Поскольку 5-ALA хорошо растворима в воде и имеет низкую цитотоксичность, она широко применяется в медицине и сельском хозяйстве (15). Сообщалось о нескольких исследованиях воздействия 5-ALA на инфекционные заболевания. Судзуки и др. сообщили, что при пероральном введении 5-ALA и иона двухвалентного железа мышам, инфицированным малярией грызунов ( Plasmodium yoelii ), мыши выжили (16).С другой стороны, его влияние на вирусную инфекцию неясно.

В ветеринарии фотодинамическая терапия (ФДТ) с использованием 5-ALA была исследована для лечения опухолей у собак (17), но, насколько нам известно, влияние 5-ALA на инфекционные заболевания у животных не исследовалось. Мы исследовали, можно ли применять 5-ALA в качестве препарата против FCoV in vitro .

Материалы и методы

Клеточные культуры, животные и вирусы

Felis catus целого плода (fcwf) -4 клетки (любезно предоставлены Dr.M. C. Horzinek из Universiteit Utrecht) выращивали в Eagles ‘MEM, содержащем 50% среду Лейбовица L-15, 5% фетальную телячью сыворотку (FCS), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Поддерживающая среда имела тот же состав, что и среда для выращивания, за исключением концентрации FCS (2%). Для первичных макрофагов были выбраны первичные макрофаги кошек. Альвеолярные макрофаги кошек были получены от четырех кошек, свободных от специфических патогенов (SPF) в возрасте 3-5 лет, путем бронхоальвеолярного лаважа сбалансированным солевым раствором Хэнка.Первичные макрофаги кошек поддерживали в D-MEM с добавлением 10% FCS, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Кошек SPF содержали в изолированном помещении с контролируемой температурой. Эксперимент с использованием животных был одобрен президентом Университета Китасато решением Институционального комитета по уходу и использованию животных Университета Китасато (18-050) и проводился в соответствии с Руководством по экспериментам на животных Университета Китасато. Размеры выборки были определены на основе нашего предыдущего исследования, и было использовано минимальное количество кошек.Штамм FCoV KU-2 типа I (FIPV-I KU-2) был выделен в нашей лаборатории. FCoV-II 79-1146 был любезно предоставлен доктором М. К. Хорзинеком из Утрехтского университета. Эти вирусы выращивали в клетках fcwf-4 при 37 ° C.

Соединения

5-ALA и цитрат железа (SFC) натрия были получены от Neopharma Japan (Токио, Япония). 5-ALA и SFC растворяли в поддерживающей среде в концентрации 200 и 50 мМ соответственно. Раствор SFC использовали в качестве растворителя 5 ALA. В день экспериментов эти соединения разбавляли до желаемых концентраций в поддерживающей среде.

Цитотоксическое действие соединений

Клетки fcwf-4 высевали на 96-луночные планшеты. Соединения добавляли в лунки в трех экземплярах. После инкубации в течение 96 часов супернатанты культур удаляли, добавляли раствор WST-8 (Kishida Chemical, Осака, Япония) и клетки возвращали в инкубатор на 1 час. Оптическую плотность полученного формазана измеряли при 450 нм с использованием 96-луночного спектрофотометрического планшета-ридера, как описано производителем. Процент жизнеспособности клеток рассчитывали по следующей формуле: Жизнеспособность клеток (%) = [(OD необработанных соединением клеток — обработанных соединением клеток) / (OD необработанных соединением клеток)] × 100.Концентрация цитотоксичности 50% (CC 50 ) определялась как цитотоксическая концентрация каждого соединения, которая снижала поглощение обработанных клеток до 50% по сравнению с таковой необработанных клеток.

Противовирусные эффекты 5-ALA

конфлюэнтных монослоев клеток fcwf-4 культивировали в среде с соединениями или без них в указанных концентрациях в 24-луночных многопланшетах при 37 ° C в течение 24 или 48 часов. Клетки промывали и вирус (MOI 0,01) адсорбировали в клетках при 37 ° C в течение 1 часа.После промывания клетки культивировали в 1,5% карбоксиметилцеллюлозе (CMC) -MEM или MEM с соединениями или без них. В случае клеток, культивированных в CMC-MEM, монослои клеток инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов, фиксировали и окрашивали 1% раствором кристаллического фиолетового, содержащим 10% забуференный формалин, а затем подсчитывали образовавшиеся бляшки. Процент уменьшения или увеличения бляшек рассчитывали по следующей формуле: Процент уменьшения бляшек (%) = [(количество бляшек в клетках, обработанных соединением) / (количество бляшек в клетках, не обработанных соединением)] × 100.ЕС 50 определяли как эффективную концентрацию соединений, которая снижала титр вируса в культуральном супернатанте инфицированных клеток до 50% по сравнению с контрольным вирусом. В случае клеток, культивируемых в MEM, культуральные супернатанты собирали через 48 часов после инфицирования, и титры вирусов измеряли с помощью анализа TCID 50 .

Первичные макрофаги кошек культивировали в среде с соединениями или без них в указанных концентрациях в 24-луночных многопланшетах при 37 ° C в течение 48 часов.После промывания PBS FIPV 79-1146 (1 × 10 4 TCID 50 ) позволяли адсорбироваться на клетках при 37 ° C с 5% CO 2 в течение 1 часа. После промывания PBS клетки культивировали в среде и собирали супернатанты. Титры вируса измеряли с помощью анализа TCID 50 .

Статистический анализ

Данные только двух групп были проанализированы с использованием теста Стьюдента t (тест Велча t ), а данные нескольких групп были проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим критерием Тьюки.Значение P <0,05 считалось значимым.

Результаты

Цитотоксические и противовирусные эффекты 5-ALA

Анализ цитотоксичности был проведен для выяснения нетоксичной концентрации 5-ALA против клеток fcwf-4 (рис. 1). Более 75% клеток fcwf-4 выживали в присутствии 1000 мкМ 5-ALA (максимальная концентрация в этом эксперименте). Контрольный носитель не проявляет цитотоксического действия на клетки fcwf-4.

Рисунок 1 . Цитотоксические эффекты 5-ALA в клетках fcwf-4.Жизнеспособность клеток Fcwf-4 измеряли с помощью анализа WST-8. Черный круг: 5-АЛА. Белый круг: Автомобиль (SFC). Носитель (контроль растворителя) был таким же, как и в растворе 5-ALA при каждом серийном разведении. Результаты показаны как среднее значение ± стандартная ошибка. Данные представляют три независимых эксперимента ( n = 3).

Влияние 5-ALA на инфекцию FIPV в клеточной линии кошек

Противовирусные эффекты 5-ALA против FIPV оценивали с помощью анализа ингибирования бляшек в клетках fcwf-4. Клетки обрабатывали 5-ALA с помощью следующих трех процедур: 24-часовая предварительная обработка (до 24 часов), 24-часовая предварительная обработка с последующим 49-часовым совместным лечением с FIPV (до 24 часов и совместная обработка). 49 ч) и 48-часовой предварительной обработки с последующей 49-часовой совместной обработкой с FIPV (до 48 часов и со-49 часов).В период до 24 часов процент ингибирования бляшек значительно увеличивался при 500 мкМ или выше (Фигуры 2A, B). В период до 24 часов и со-49 часов процент ингибирования бляшек значительно увеличивался при 125 мкМ или выше (Фигуры 2C, D). В период до 48 часов и со-49 часов процент ингибирования бляшек при FIPV типа I 125 мкМ 5-ALA достиг 75% (рисунки 2E, F). Контроль носителя, SFC, не оказывал ингибирующего действия на образование бляшек на FCoV ни при каких условиях. Согласно анализу титрования, продукция FIPV типа I и типа II была значительно снижена на 250 и 500 мкМ 5-ALA (рис. 3).

Рисунок 2 . Анализ ингибирования бляшек FIPV в клетках fcwf-4, обработанных 5-ALA. (A, B) Влияние 24-часовой предварительной обработки на противовирусную активность 5-ALA. Скорость ингибирования бляшек инфицированных FIPV клеток fcwf-4, предварительно обработанных 5-ALA в течение 24 часов. (C, D) Влияние 24-часовой предварительной обработки и 48-часовой последующей обработки на противовирусную активность 5-ALA. Скорость ингибирования бляшек инфицированных FIPV клеток fcwf-4, предварительно обработанных в течение 24 часов и после обработки в течение 48 часов 5-ALA. (E, F) Влияние 48-часовой предварительной обработки и 48-часовой последующей обработки на противовирусную активность 5-ALA. Скорость ингибирования бляшек инфицированных FIPV клеток fcwf-4, предварительно обработанных в течение 48 часов и после обработки в течение 48 часов 5-ALA. (A, C, E) тип I FIPV. (B, D, F) тип II FIPV. Черная полоса: 5-ALA. Белая полоса: носитель (контроль растворителя). Результаты показаны как среднее значение ± стандартная ошибка. Данные представляют четыре независимых эксперимента ( n = 4). ** p <0,01 (* p <0.05) по сравнению с автомобилем.

Рисунок 3 . Ингибирование инфекции FIPV с помощью 5-ALA в клетках fcwf-4. (A, C) Влияние 48-часовой предварительной обработки и 48-часовой последующей обработки на противовирусную активность 250 мкМ 5-ALA. (B, D) Влияние 48-часовой предварительной обработки и 48-часовой последующей обработки на противовирусную активность 500 мкМ 5-ALA. (A, B) 250 мкМ 5-ALA. (A, B) тип I FIPV. (C, D) тип II FIPV. Черный круг: 5-АЛА. Белый кружок: носитель (контроль растворителя).Результаты показаны как среднее значение ± стандартная ошибка. Данные представляют четыре независимых эксперимента ( n = 4). ** p <0,01 (* p <0,05) по сравнению с носителем.

Влияние 5-ALA на инфекцию FIPV в клеточной линии кошек

макрофагов, инфицированных FIPV, участвуют в прогрессировании симптомов FIP до тяжелого состояния. Мы исследовали, подавляет ли 5-ALA размножение FIPV в макрофагах. В этом эксперименте использовали тип II FIPV 79-1146 с высокой способностью к размножению в первичных макрофагах кошек.Продукция вируса в макрофагах, инфицированных FIPV, была снижена на 250 мкМ 5-ALA у трех из четырех кошек (рис. 4).

Рисунок 4 . Подавление инфекции FIPV в макрофагах. Влияние на противовирусную активность 5-ALA (250 мкМ) в первичных макрофагах кошек. Черная полоса: 5-ALA. Белая полоса: носитель (контроль растворителя). Данные представляют собой два независимых эксперимента ( n = 3).

Обсуждение

5-АЛК является промежуточным продуктом синтеза тетрапиррола у животных, растений и микроорганизмов (13–15).В 1980-х годах сообщалось о возможности эффективности 5-ALA в растениях (18), но было трудно произвести 5-ALA в количестве, достаточном для практического использования, потому что только небольшое количество продуцируется в микроорганизмах. После того, как Nishikawa et al. разработали метод массового производства 5-ALA с использованием бактерий (19), эффективность 5-ALA была подтверждена не только в сельском хозяйстве, но также в медицинских и биологических областях. 5-АЛК недорога и практически используется в качестве добавки для улучшения продуктивности животных и иммунного ответа в области ветеринарии (14, 20).

5-ALA ингибировал рост FIPV в клетках fcwf-4. Сообщалось, что металлические комплексы метаболита 5-ALA, протопорфирина IX (PpIX) обладают антивирусной активностью (21–23). Металлический комплекс PpIX, гем, подавляет размножение вируса денге (21). С другой стороны, гем не подавляет размножение вируса Зика (23). Неясно, подавляет ли гем размножение FCoV. Как правило, увеличение внутриклеточного гема стимулирует выработку гемеоксигеназы-1 (HO-1), фермента, разрушающего гем.Сообщалось, что HO-1 индуцирует противовирусную активность (24, 25). Однако в предварительном эксперименте мы подтвердили, что уровень экспрессии мРНК HO-1 не изменился в клетках, обработанных 250 мкМ 5-ALA (данные не показаны). Исходя из этого, 5-ALA-индуцированное ингибирование инфекции FIPV происходит за счет фактора, отличного от гема и HO-1.

В последнее время было проведено много исследований терапевтических препаратов от FIP. Были идентифицированы многие препараты, эффективные в отношении FIP in vitro , и подтверждено, что некоторые из них проявляют лечебный эффект при введении кошкам с FIP (10–12).Однако в случаях с неврологическими проявлениями действие всех препаратов было слабым. Причиной этого считался плохой перенос этих препаратов в центральную нервную систему; Следовательно, необходимо лекарство, проявляющее противовирусное действие против FIPV, способное проникать в ткань мозга. 5-ALA — это низкомолекулярная аминокислота, которая может переноситься в ткани мозга (26). Кроме того, сообщалось, что диффузия 5-ALA из крови в нормальную ткань мозга очень низкая (27), что позволяет предположить, что она вызывает меньше побочных эффектов.FIP можно точно диагностировать только путем обнаружения антигена FCoV в очаге поражения (28). Однако, когда лечение начинается после постановки точного диагноза, симптомы прогрессируют, и во многих случаях состояние не поддается лечению. Следовательно, если доступен препарат, который можно вводить профилактически перед диагностикой FIP, можно предотвратить прогрессирование симптомов, для которого 5-ALA может быть идеальным средством. Однако в нашем эксперименте с использованием клеток-мишеней FIPV, макрофагов, противовирусные эффекты 5-ALA не наблюдались у некоторых кошек.Следовательно, когда 5-ALA используется в качестве терапевтического препарата для лечения FIP, препараты против FCoV, такие как GS-441524 (29), GC-376 (30), U18666A (31) и итраконазол (32), или анти- Одновременно следует использовать противовоспалительные препараты, такие как антитела против TNF-альфа (33).

В полевых условиях FECV в основном передается между кошками, тогда как горизонтальное инфицирование FIPV между кошками считается редким (34). Было высказано предположение, что FIPV возникает в результате генетической мутации FECV. Таким образом, если есть средства для предотвращения инфекции FECV на ежедневной основе, можно предотвратить развитие FIP.Вакцины, способной предотвратить инфекцию FECV, не разработано. Адди и др. сообщили, что экскреция гена вируса с фекалиями исчезла у кошек, инфицированных FECV, получавших синтетический аналог аденозина (35). Следовательно, ожидается удаление FECV, инфицированного кишечником, путем введения противовирусного препарата кошкам, инфицированным FECV. Однако синтетические аналоги аденозина могут вызывать мутацию гена коронавируса (36). Более того, даже несмотря на то, что уровень гена FECV в кале снизился ниже предела обнаружения у кошек, получавших синтетический аналог аденозина, FECV может латентно инфицировать кишечник или другие ткани.Чтобы предотвратить мутацию гена FECV и надежно искоренить инфекцию FECV, необходимо длительное введение синтетического аналога аденозина, но это нереально, поскольку это лекарство слишком дорогое. С другой стороны, 5-ALA практически используется в качестве добавки. 5-ALA имеет низкую токсичность для животных и растений, что убедительно свидетельствует о возможности длительного введения 5-ALA кошкам. Необходимо выяснить, можно ли использовать 5-ALA в качестве добавки для предотвращения развития FIP у кошек, инфицированных FECV, в будущем.

В этом исследовании мы подтвердили возможность того, что 5-ALA ингибирует размножение FIPV и производство TNF-альфа. Поскольку 5-ALA — это аминокислота, присутствующая в организме, возможно ее немедленное введение. Однако необходимо вводить 5-ALA кошкам с FIP и наблюдать, можно ли получить терапевтический эффект. Кроме того, необходимо исследовать, устраняет ли длительное введение 5-ALA вирус и ингибирует ли развитие FIP у кошек, инфицированных FECV.

Заявление о доступности данных

Оригинальные материалы, представленные в исследовании, включены в статью / дополнительные материалы, дальнейшие запросы можно направлять соответствующим авторам.

Заявление об этике

Исследование на животных было рассмотрено и одобрено президентом Университета Китасато по решению Институционального комитета по уходу и использованию животных Университета Китасато.

Авторские взносы

TT задумал и разработал исследование, проанализировал данные и написал рукопись. TT и KS собрали данные. TT, KS и TD собрали и обработали образцы. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

Финансирование

Авторы заявляют, что это исследование получило финансирование от Neopharma Japan Co., Ltd. Финансирующая организация не участвовала в разработке, сборе, анализе, интерпретации данных, написании этой статьи или решении представить ее для публикации.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Список литературы

2. Мотокава К., Хохдацу Т., Айзава С., Кояма Х., Хашимото Х. Молекулярное клонирование и определение последовательности гена пепломерного белка вируса инфекционного перитонита кошек типа I. Arch Virol . (1995) 140: 469–80. DOI: 10.1007 / BF01718424

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

3. Хохдацу Т., Окада С., Ишизука Й., Ямада Х., Кояма Х. Распространенность кошачьих коронавирусных инфекций I и II типов у кошек. J Vet Med Sci . (1992) 54: 557–62. DOI: 10.1292 / jvms.54.557

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Куммроу М., Мели М.Л., Хессиг М., Генци Э., Польша А., Педерсен Н.С. и др.(2005). Серотипы 1 и 2 коронавируса кошек: распространенность серотипа и связь с заболеванием в Швейцарии. Clin Diagn Lab Immunol . 12: 1209–15. DOI: 10.1128 / CDLI.12.10.1209-1215.2005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5. Ван Ю.Т., Чуэ Л.Л., Ван СН. 8-летнее эпидемиологическое исследование, основанное на экспрессируемых бакуловирусами тип-специфических белках-шипах для дифференциации инфекций, вызванных коронавирусом кошек I и II типа. BMC Vet Res . (2014) 10: 186.DOI: 10.1186 / s12917-014-0186-7

CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Педерсен NC. Обзор инфекций, вызванных кишечным коронавирусом кошек и инфекционным перитонитом. Feline Pract . (1995) 23: 7–21.

Google Scholar

7. Чанг Х.В., Эгберинк Х.Ф., Халпин Р., Спиро Диджей, Роттье П.Дж. Пептид слияния шипованного белка и вирулентность коронавируса кошек. Emerg Infect Dis . (2012) 18: 1089. DOI: 10.3201 / eid1807.120143

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8.Licitra BN, Millet JK, Regan AD, Hamilton BS, Rinaldi VD, Duhamel GE и др. Мутация в сайте расщепления спайкового белка и патогенез коронавируса кошек. Emerg Infect Dis . (2013) 19: 1066. DOI: 10.3201 / eid1907.121094

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Педерсен NC, Ким Y, Лю Х., Galasiti Kankanamalage AC, Eckstrand C, Groutas WC, et al. Эффективность ингибитора 3C-подобной протеазы при лечении различных форм приобретенного инфекционного перитонита у кошек. J Feline Med Surg . (2018) 20: 378–92. DOI: 10.1177 / 1098612X17729626

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. Педерсен NC, Перрон М., Баннаш М., Монтгомери Э., Мураками Э., Лиепниекс М. и др. Эффективность и безопасность аналога нуклеозидов GS-441524 для лечения кошек с естественным инфекционным перитонитом кошек. J Feline Med Surg . (2019) 21: 271–81. DOI: 10.1177 / 1098612X19825701

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12.Kameshima S, Kimura Y, Doki T, Takano T, Park CH, Itoh N. Клиническая эффективность комбинированной терапии итраконазолом и преднизолоном для лечения эффузивного инфекционного перитонита кошек. J Vet Med Sci . (2020) 82: 1492–6. DOI: 10.1292 / jvms.20-0049

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Хендави А.О., Хаттаб М.С., Сугимура С., Сато К. Эффекты 5-аминолевулиновой кислоты в качестве добавки на продуктивность животных, статус железа и иммунный ответ у сельскохозяйственных животных: обзор. Животные. (2020) 10: 1352. DOI: 10.3390 / ani10081352

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Сасаки К., Ватанабе М., Танака Т., Танака Т. Биосинтез, биотехнологическое производство и применение 5-аминолевулиновой кислоты. Приложение Microbiol Biotechnol . (2002) 58: 23–9. DOI: 10.1007 / s00253-001-0858-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Сузуки С., Хикосака К., Балогун Е.О., Комацуя К., Нийкура М., Кобаяши Ф. и др. In vivo Лечебный и защитный потенциал перорально вводимой 5-аминолевулиновой кислоты плюс иона двухвалентного железа против малярии. Противомикробные агенты Chemother . (2015) 59: 6960–7. DOI: 10.1128 / AAC.01910-15

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Осаки Т., Ёкоэ И., Огура С., Такахаши К., Мураками К., Иноуэ К. и др. Фотодинамическое обнаружение опухолей молочной железы собак после перорального приема 5-аминолевулиновой кислоты. Vet Comp Oncol .(2017) 15: 731–9. DOI: 10.1111 / vco.12213

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Rebeiz CA, Montazer-Zouhoor A, Hopen HJ, Wu SM. Фотодинамические гербициды: 1. Понятие и феноменология. Enzyme Microb Technol . (1984) 6: 390–401. DOI: 10.1016 / 0141-0229 (84)

-7

CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Нисикава С., Ватанабе К., Танака Т., Миячи Н., Хотта Ю., Муроока Ю. Мутанты Rhodobacter sphaeroides, которые накапливают 5-аминолевулиновую кислоту в аэробных и темных условиях. J Biosci Bioeng . (1999) 87: 798–804. DOI: 10.1016 / S1389-1723 (99) 80156-X

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Сасаки А., Иватани Н., Харада К. Эффект улучшения 5-аминолевулиновой кислоты на гиперлипидемию у миниатюрных собак шнауцера: открытое исследование в 5 случаях одной родословной. Йонаго Акта Мед . (2020) 63: 234–8. DOI: 10.33160 / yam.2020.08.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21.Ассунсао-Миранда I, Крус-Оливейра С., Нерис РЛС, Фигейредо С.М., Перейра ЛПС, Родригес Д. и др. Инактивация вирусов денге и желтой лихорадки гемом, кобальт-протопорфирин IX и олово-протопорфирин IX. J Appl Microbiol . (2016) 120: 790–804. DOI: 10.1111 / jam.13038

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Cruz-Oliveira C, Almeida AF, Freire JM, Caruso MB, Morando MA, Ferreira VN, et al. Механизмы инактивации вируса везикулярного стоматита протопорфирином IX, цинк-протопорфирином IX и мезопорфирином IX. Противомикробные агенты Chemother . (2017) 61: e00053–17. DOI: 10.1128 / AAC.00053-17

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Нерис Р.Л., Фигейредо С.М., Хига Л.М., Араужо Д.Ф., Карвалью Калифорния, Версоза Б.Р. и др. Копротопорфирин IX и Sn-протопорфирин IX инактивируют вирусы Зика, Чикунгунья и другие арбовирусы, воздействуя на вирусную оболочку. Научный сотрудник . (2018) 8: 9805. DOI: 10.1038 / s41598-018-27855-7

CrossRef Полный текст | Google Scholar

25.Tseng CK, Lin CK, Wu YH, Chen YH, Chen WC, Young KC, et al. Гемоксигеназа 1 человека является потенциальным фактором клетки-хозяина против репликации вируса денге. Научный сотрудник . (2016) 6: 32176. DOI: 10.1038 / srep32176

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Новотны А., Сян Дж., Штумер В., Тойшер Н.С., Смит Д.Э., Кип РФ. Механизмы захвата 5-аминолевулиновой кислоты сосудистым сплетением. Дж Нейрохим . (2000) 75: 321–8. DOI: 10.1046 / j.1471-4159.2000.0750321.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Эннис С.Р., Новотны А., Сян Дж., Шакуи П., Масада Т., Штумер В. и др. Транспорт 5-аминолевулиновой кислоты между кровью и мозгом. Мозг Res . (2003) 959: 226–34. DOI: 10.1016 / S0006-8993 (02) 03749-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Мерфи Б.Г., Перрон М., Мураками Е., Бауэр К., Парк И., Экстранд С. и др. Аналог нуклеозидов GS-441524 сильно ингибирует вирус инфекционного перитонита кошек (FIP) в исследованиях культур тканей и экспериментальных кошачьих инфекциях. Ветеринарная микробиология . (2018) 219: 226–33. DOI: 10.1016 / j.vetmic.2018.04.026

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Ким И, Лю Х., Галасити Канканамалаге А.К., Вирасекара С., Хуа Д.Х., Грутас В.С. и др. Обратное развитие смертельной коронавирусной инфекции у кошек с помощью ингибитора протеазы коронавируса широкого спектра действия. PLoS Pathog . (2016) 12: e1005531. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1005531

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

31.Takano T, Endoh M, Fukatsu H, Sakurada H, Doki T, Hohdatsu T. Ингибитор транспорта холестерина U18666A подавляет инфекцию коронавируса кошек I типа. Антивирусная защита . (2017) 145: 96–102. DOI: 10.1016 / j.antiviral.2017.07.022

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

33. Доки Т., Такано Т., Кавагое К., Кито А., Хохдацу Т. Терапевтический эффект кошачьих моноклональных антител против TNF-альфа при инфекционном перитоните кошек. Res Vet Sci .(2016) 104: 17–23. DOI: 10.1016 / j.rvsc.2015.11.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35. Адди Д.Д., Карран С., Беллини Ф., Кроу Б., Шихан Э., Украинчук Л. и др. Oral Mutian® X остановил распространение фекального коронавируса кошек от естественно инфицированных кошек. Res Vet Sci . (2020) 130: 222–9. DOI: 10.1016 / j.rvsc.2020.02.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Как два препарата от коронавируса для кошек могут помочь людям в борьбе с COVID-19

Стремясь найти лекарства против COVID-19, исследователи изучают множество возможностей, даже лекарства, используемые для спасения жизни кошек.

Кошки могут заразиться почти всегда смертельной болезнью, вызванной коронавирусом, поражающим только кошек. Теперь предварительные исследования показывают, что два экспериментальных препарата, которые могут вылечить это заболевание у кошек, называемое кошачьим инфекционным перитонитом, могут помочь в лечении людей, инфицированных SARS-CoV-2, коронавирусом, стоящим за пандемией.

В лабораторных экспериментах один из препаратов, названный GC376, отключает ключевой фермент, который некоторые коронавирусы, включая SARS-CoV-2, используют для репликации.Другой, названный GS-441524, является противовирусным аналогом ремдесивира, первого препарата, ускоряющего выздоровление людей от SARS-CoV-2 в клинических испытаниях ( SN: 4/29/20 ).

«Оба препарата оказались очень эффективными при лечении кошек с инфекционным перитонитом кошек и, как правило, без каких-либо других форм лечения», — говорит Нильс Педерсен, ветеринар, изучающий кошачий коронавирус в Калифорнийском университете в Дэвисе. Однако ни один из этих препаратов еще не одобрен U.S. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов для кошек, а тем более людей.

Подпишитесь на электронную почту о последних новостях и исследованиях о коронавирусе

Хотя у большинства животных с кошачьим инфекционным перитонитом симптомы не проявляются, у некоторых кошек может развиться тяжелое заболевание, если вирус мутирует, чтобы заразить определенный тип иммунных клеток. Когда это происходит, коронавирус распространяется по всему телу кошки, вызывая смертельную воспалительную реакцию, которая может вызвать паралич или скопление жидкости в легких.

В этом отношении кошачий коронавирус похож на SARS-CoV-2. И тяжелая форма COVID-19 у людей, и случаи инфекционного перитонита у кошек вызваны дисфункциональным воспалительным иммунным ответом, говорит Джули Леви, ветеринар из Университета Флориды в Гейнсвилле.

GC376 работает, не позволяя ключевому ферменту под названием М-протеаза, который содержится в ряде различных коронавирусов, расщеплять длинные цепочки вирусных белков. РНК-вирусы, такие как SARS-CoV-2, часто образуют такие белковые цепочки, которые ферменты протеазы разрезают на более мелкие части, которые затем помогают вирусу в большей степени использовать себя в клетке ( SN: 3/10/20 ).Нарушение способности протеазы разрезать может остановить репликацию вируса.

В исследовании 2016 года шесть из восьми кошек выздоровели от инфекции смертельной формой кошачьего коронавируса после лечения этим препаратом, сообщили Педерсен и его коллеги в PLOS Pathogens . Две умершие кошки были среди четырех, у которых развились серьезные симптомы, такие как желтуха и высокая температура. Но эти кошки, возможно, пострадали от осложнений из-за отдельного лекарства, которое им дали для облегчения болезни, пишет команда.

В исследовании также сообщается, что в пробирке GC376 может остановить другие коронавирусы, кроме кошачьего. Препарат, например, подавляет протеазы двух других вирусов, которые вызвали серьезные вспышки среди людей: коронавируса SARS, от которого люди заболели в 2002 и 2003 годах, и ближневосточного респираторного синдрома, или MERS, коронавируса ( SN: 4/23/03 ; СН: 27.02.13) .

Надежная журналистика имеет свою цену.

Ученые и журналисты разделяют главную веру в то, что нужно задавать вопросы, наблюдать и проверять, чтобы достичь истины. Science News сообщает о важнейших исследованиях и открытиях в научных дисциплинах. Чтобы это произошло, нам нужна ваша финансовая поддержка — каждый вклад имеет значение.

Подпишитесь или пожертвуйте сейчас

Исследователи, в том числе Цзюнь Ван, химик, изучающий разработку противовирусных препаратов в Университете Аризоны в Тусоне, обнаружили, что GC376 может остановить работу протеазы SARS-CoV-2 в пробирке. Ван, который сообщил об этих результатах 15 июня в Cell Research , говорит, что его команда сейчас тестирует соединение на мышах.И в результатах, представленных 4 августа на виртуальной встрече Американской кристаллографической ассоциации, биохимик Джоан Лемье и его коллеги показали, что GC376 не только ингибирует фермент SARS-CoV-2 в пробирке, но также может препятствовать репликации вируса в выращенных в лаборатории клетках обезьян. Эти результаты также были опубликованы 5 мая на сайте bioRxiv.org.

Основываясь на этих выводах и на том факте, что препарат безопасен и эффективен для кошек, компания, производящая GC376, Anivive Lifesciences, базируется в Лонг-Бич, Калифорния., в настоящее время работает над продвижением клинических испытаний на людях, — говорит Лемье из Университета Альберты в Эдмонтоне, Канада.

«Тот факт, что это лекарство уже было разработано и доказало свою эффективность в лечении инфекционного перитонита кошек, действительно предвещает хорошее», — говорит Лемье.

Другой препарат для кошек, GS-441524, который был эффективен против коронавируса кошек, похож на ремдесивир. Соединения имеют схожую химическую структуру, хотя ремдесивир имеет дополнительную часть, которая лучше помогает ему проникать в клетки.

Ремдесивир и GS-441524, препараты, разработанные биофармацевтической компанией Gilead Sciences, базирующейся в Фостер-Сити, штат Калифорния, имитируют строительный блок генетической молекулы РНК, из которой состоит генетический материал коронавируса. По мере того, как вирус реплицируется, он включает строительный блок-подражатель в свою РНК, что предотвращает добавление вирусными ферментами дополнительных строительных блоков, останавливая репликацию ( SN: 7/13/20 ).

Педерсен и его коллеги сообщили, что GS-441524 является эффективным средством лечения инфекционного перитонита кошек в июне 2018 года в разделе Veterinary Microbiology .Препарат не только подавлял репликацию вируса в клетках, выращенных в лаборатории, но и успешно лечил 10 из 10 зараженных коронавирусом кошек, у которых развилось тяжелое заболевание. В отдельном исследовании, опубликованном в феврале 2019 года в журнале Journal of Feline Medicine and Surgery , 25 из 26 кошек, получавших препарат в течение как минимум 12 недель, выжили.

Есть также некоторые свидетельства того, что GS-441524 может помочь людям с COVID-19. Исследование, проведенное 21 июля в Cell Reports , показало, что препарат может ингибировать репликацию SARS-CoV-2 в выращенных в лаборатории клетках обезьян и людей.Ремдесивир, однако, был более активен в клетках легких человека, тогда как GS-441524 был более активен в клетках обезьян.

Смотрите все наши репортажи о вспышке коронавируса

Несмотря на столь многообещающие результаты у кошек, препарат не доступен для использования на этих животных. И, вместо этого сосредоточив внимание на ремдесивире, который представляет собой сложную молекулу, которую труднее сделать, критики говорят, что компания сосредотачивается на потенциально более прибыльном лекарстве и поэтому ставит свою прибыль выше общественного здравоохранения.Компания Gilead не ответила на вопросы из Science News о лицензировании GS-441524 . Но компания отметила, что она могла быстро перейти к ремдесивиру, потому что препарат уже прошел испытания на безопасность человека.

Этот препарат был протестирован на людях с Эболой во время вспышки 2014–2016 годов в Западной Африке и вспышки 2018–2020 годов в Конго. Хотя он не был эффективен против лихорадки Эбола, знание того, что он не причинит вреда пациентам, позволило Gilead обойти этот процесс и начать тестирование против SARS-CoV-2.Сейчас он проходит клинические испытания COVID-19, некоторые из которых показали, что препарат может ускорить выздоровление пациента. 10 августа компания Gilead подала заявку на одобрение FDA для ремдесивира.

GS-441524, с другой стороны, никогда не вводился людям. И хотя ученые могут делать предположения о безопасности на основе исследований на животных, наличие данных о GS-441524 на людях, конечно, по-прежнему важно, предупреждает Э. Сьюзан Амириан, молекулярный эпидемиолог из Университета Райса в Хьюстоне.

Компания Gilead начала доклинические исследования для сравнения обоих препаратов, сообщил представитель компании Крис Ридли.

Хотя еще неизвестно, сработают ли GS-441524 или GC376 против SARS-CoV-2 у людей, эти препараты являются примером того, как понимание связи между здоровьем животных и человека может помочь в борьбе с новыми вирусами. «Отчасти из-за исследований кошачьего инфекционного перитонита, многие ветеринары, похоже, осознали на раннем этапе пандемии COVID-19, что ремдесивир может быть многообещающим кандидатом», — говорит Амириан. «Параллели между медициной человека и ветеринарной медициной поразительны.”

Лекарство от коронавируса кошек ингибирует основную протеазу SARS-CoV-2 и блокирует репликацию вируса

Синтез GC373, GC376 и субстрата FRET-пептида

Протоколы, детали синтеза, характеристики соединений и соответствующая методологическая информация приведены в дополнительных методах . Идентичность и чистоту (> 95%) всех соединений определяли с помощью хроматографии (силикагель или RP-18 HPLC), полностью назначили спектры ЯМР 1 H и 13 C и масс-спектры высокого разрешения.

Клонирование, экспрессия и очистка SARS-CoV M

pro и SARS-CoV-2 M pro

ДНК, кодирующая основную протеазу M pro из SARS-CoV-2 (Genbank: MN

7.3) был получен от BioBasic Inc. (Онтарио, Канада) и содержит сайт рестрикции

Eco RI выше и сайт рестрикции Hin dIII ниже слитого гена. Кодон гена M pro был оптимизирован для экспрессии в Escherichia coli .Ген слияния был клонирован в сайты рестрикции Eco RI и Hin dIII вектора экспрессии pET SUMO (малый убиквитин-подобный модификатор) (Invitrogen), таким образом гарантируя, что белок SARS-CoV-2 M pro находится в рамка с His-меченным белком SUMO. Полученную плазмиду трансформировали в E. coli BL21 (DE3), индуцировали 0,5 мМ изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозидом, и белок экспрессировали в течение 4–5 ч при 37 ° C. Клетки собирали центрифугированием (4400 × г в течение 10 мин при 4 ° C) и суспендировали в буфере для лизиса (20 мМ трис-HCl, pH 7.8, 150 мМ NaCl, 5 мМ имидазол). Клетки лизировали обработкой ультразвуком, обломки клеток удаляли центрифугированием (27000 × г в течение 10 мин при 4 ° C), и супернатант наносили на колонку со смолой Ni-NTA (Qiagen). После промывания смолы 10 объемами колонки буфера для лизиса, содержащего 20 мМ имидазол, слитый белок элюировали 40–500 мМ имидазолом в буфере для лизиса. Элюированные фракции анализировали электрофорезом в додецилсульфат-полиакриламидном геле (SDS-PAGE), образцы с представляющим интерес белком объединяли, диализовали против буфера для лизиса, содержащего 1 мМ DTT, при 4 ° C и концентрировали с использованием фильтра Amicon Ultra-15 (Millipore ) с MWCO 10 кДа.Слитый белок расщепляли His-меченной протеазой SUMO (McLab, Южный Сан-Франциско, Калифорния) при 4 ° C в течение 1-2 часов для удаления метки SUMO. Затем смесь для расщепления пропускали через колонку со смолой Ni-NTA. Проходящий поток, содержащий SARS-CoV-2 M pro , собирали и анализировали с помощью SDS-PAGE. Белок SARS-CoV-2 M pro дополнительно очищали с использованием эксклюзионной хроматографической колонки (G-100, GE Healthcare), уравновешенной 20 мМ Трис, 20 мМ NaCl, 1 мМ DTT, pH 7,8. Фракции, содержащие белок SARS-CoV-2 M pro , объединяли и концентрировали с использованием фильтра Amicon Ultra-15 с MWCO 10 кДа.Кроме того, образец слитого белка SUMO-SARS-CoV-2 M pro также очищали с использованием эксклюзионной хроматографии и концентрировали, как описано выше. Плазмида, кодирующая SARS-CoV M pro с N-концевой His-меткой перед сайтом расщепления FactorX, была любезным подарком доктора Майкла Джеймса. Белок был очищен согласно предыдущему протоколу 9 .

Масс-спектрометрия SARS-CoV-2 M

pro

Масса свободного SARS-CoV-2 M pro была подтверждена HR-MALDI на MALDI-TOF (Bruker Ultrafelxtreme, Bruker Daltronics, США) и ЖХ-МС на приборе ESI-TOF (Agilent Technologies 6220, Калифорния, США) с использованием ионизации электрораспылением и анализа с помощью пакета программного обеспечения Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis (версия B.03.01 SP3).

Кинетика ферментов SARS-CoV-2 и SARS-CoV M

pro

Синтезированный флуоресцентный субстрат, содержащий сайт расщепления (обозначен стрелкой, ↓) SARS-CoV-2 M pro (Abz-SVTLQ ↓ SG-Tyr (NO 2 ) -R) использовали для анализа расщепления на основе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) 15 . Протеазные реакции SARS-CoV-2 M pro и SARS-CoV M pro по отношению к флуоресцентному субстрату проводили в буфере активности (20 мМ Bis-Tris, pH 7.8, 1 мМ DTT) при 37 ° C в течение 10 мин. Конечная концентрация протеаз, используемых в анализе, была зафиксирована на уровне 80 нМ, а концентрации субстрата варьировали от 0,1 до 500 мкМ. Реакцию начинали с фермента, и сигнал флуоресценции продукта расщепления пептида Abz-SVTLQ контролировали при длине волны излучения 420 нм с возбуждением на длине волны 320 нм с использованием флуоресцентного спектрофотометра Flx800 (BioTek). Перед кинетическими расчетами было проверено, что пропорциональность между испускаемой флуоресценцией и количеством субстрата, используемого в анализе, была линейной.Была выбрана минимальная концентрация фермента и время реакции, которые давали линейную зависимость количества образующегося продукта от времени. Начальные скорости в соответствующих относительных единицах флуоресценции в единицу времени (ΔRFU / s) были преобразованы в количество расщепленного субстрата в единицу времени (мкМ / с) путем подгонки к калибровочной кривой для свободного Abz-SVTLQ. Все данные были скорректированы с учетом эффектов внутреннего фильтра в соответствии с принятым литературным протоколом 17 . Короче говоря, определяли сигнал флуоресценции (RFU) при каждой концентрации субстрата и определяли его как f (FRET).Затем 5 мкл свободного аминобензоил-SVTLQ в конечной концентрации 5 мкМ добавляли к каждой концентрации субстрата и измеряли флуоресценцию: f (FRET + аминобензоил-SVTLQ). Одновременно были взяты эталонные показания с той же концентрацией свободного аминобензоил-SVTLQ, которые были определены как f (ref). Коррекция внутреннего фильтра была получена как: corr% = (f (FRET + аминобензоил-SVTLQ) — f (FRET)) / f (ref) × 100%. Скорректированная начальная скорость реакции была рассчитана как v = v o / (corr%). v o представляет начальную скорость каждой реакции.

Кинетические параметры ( V max и K m ) были получены путем аппроксимации графика зависимости скорректированных начальных скоростей от концентраций субстрата уравнением Михаэлиса-Ментен, v = v max × [ S ] / ( K m + [ S ]) с помощью программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad 8.3.1 ). k cat / K m рассчитано в соответствии с уравнением, k cat / K m = v max / ([ E ] × К м ). Для каждой точки данных проводили трехкратные эксперименты, и значение представляли как среднее ± стандартное отклонение (SD).

Параметры ингибирования

Исходные растворы GC373 и GC376 готовили с 10% водным диметилсульфоксидом (ДМСО).Для определения IC 50 80 нМ SARS-CoV-2 M pro инкубировали с GC373 или GC376 при различных концентрациях от 0 до 100 мкМ в 20 мМ бис-трис, pH 7,8, 1 мМ DTT при 37 ° C в течение 10 мин. Протеазную реакцию начинали добавлением 100 мкМ субстрата. Программное обеспечение GraphPad Prism (GraphPad 8.3.1) использовалось для расчета значений IC 50 . Оба ингибитора тестировали на неспецифическое связывание, выполняя эталонное титрование в отсутствие DTT, показывающего отсутствие влияния на полученные показания флуоресценции (данные не показаны).

Кристаллизация

Для кристаллизации очищенный SARS-CoV-2 M pro диализовали против буфера, содержащего 10 мМ NaCl и 5 мМ Tris-HCl pH 8,0, в течение ночи при 4 ° C и концентрировали с помощью центробежного фильтра Millipore (10 кДа Порог MW) до 9 мг / мл. Белок инкубировали с пяти молярным избытком ингибитора при 4 ° C в течение 2 ч перед кристаллизацией. Для SARS-CoV-2 M pro белок подвергали скринингу кристаллизации PACT (молекулярные размеры), при этом для обоих ингибиторов были выявлены совпадения в нескольких условиях.Для Apo-SARS-CoV-2 M pro лучшие кристаллы наблюдались с висячими каплями при комнатной температуре в соотношении 1: 1 с маточным раствором 0,2 M сульфата натрия, 0,1 M бис-трис пропана pH 6,5 и 20 % мас. / об. ПЭГ 3350. SARS-CoV-2 M pro с ингибиторами, кристаллизованный из маточной жидкости, содержащей 0,2 М хлорид натрия 0,1 М 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES) pH 7,0 и 20 % мас. / об. PEG 6000. Перед замораживанием кристаллы инкубировали с 15% глицерином в качестве криопротектора.Первоначально кристаллы подвергались скринингу на нашем домашнем источнике 007 MicroMax (Rigaku Inc.) с скринингом кристаллов и окончательным сбором данных в Стэнфордском источнике синхротронного излучения (SSRL), канал 12–2 с Blu-Ice с использованием интерфейса Web-Ice 30 .

Сбор дифракционных данных, определение фазы, построение модели и уточнение

Все наборы дифракционных данных были собраны с использованием синхротронного излучения с длиной волны 0,97946 Å на канале 12–2 SSRL в Калифорнии, США, с использованием детектора Dectris PILATUS 6 M.Несколько наборов данных было собрано из кристаллов свободного фермента SARS-CoV-2 M pro , а также обработанных GC376 и GC373. Для обработки наборов данных использовались XDS2 31 и Scala. Набор данных дифракции свободного SARS-CoV-2 M pro был обработан с разрешением 1,75 Å в пространственной группе P21 (дополнительная таблица 1). Для комплекса SARS-CoV-2 M pro с GC376 и GC373 собранный набор данных был обработан с разрешением 1,9 Å и 2.0 Å и в пространственной группе C2 (дополнительная таблица 1). Все три структуры были определены путем молекулярного замещения кристаллической структурой свободного фермента SARS-CoV-2 M pro (запись PDB 6Y7M) в качестве модели поиска с использованием программы Phaser от Phenix 32 , версия v1. 18.1-3855). Ligand Fit от Phenix использовался для подбора плотности обоих ингибиторов на предварительно рассчитанной карте из уточнения Phenix с использованием кода лиганда K36. Уточнение трех структур было выполнено с помощью phenix.доработать в программном обеспечении Phenix. Статистика дифракции, обработки данных и уточнения модели приведена в (Дополнительная таблица 1). Модель была проверена с помощью графиков Рамачандрана, а окончательные модели отображены с использованием программного обеспечения молекулярной графики PyMOL (версия 1.7.6.5 Schrödinger, LLC).

Определение EC

50 с помощью анализа уменьшения образования зубного налета

SARS-CoV-2 / CANADA / VIDO 01/2020 был любезным подарком от Даррила Фалзарано (Университет Саскачевана). Клетки Е6 Vero (почки самки зеленой мартышки) инфицировали с MOI 0.0001 БОЕ / клетка в инфекционной среде, состоящей из модифицированной Дульбекко среды Игла с добавлением 1 × незаменимых аминокислот (Gibco), 10 мМ HEPES, 2% фетальной бычьей сыворотки, 50 МЕ / мл пенициллина, 50 МЕ / мл стрептомицина, различные дозы GC373 или GC376. Через 1 ч инфицирующую среду удаляли и монослои покрывали ростовой средой (MEM с добавлением 10 мМ HEPES), содержащей 1,2% Avicel RC-591 (DuPont), содержащую соответствующую дозу GC373 или GC376. Через 48 ч клетки фиксировали в 10% формальдегиде и окрашивали 0.5% (мас. / Об.) Кристаллического фиолетового. Подсчитывали бляшки и данные наносили на график в виде% ингибирования по сравнению с логарифмом 10 [лекарство] с использованием Prism (GraphPad). Значения EC 50 были определены с использованием анализа нелинейной регрессии. Эксперименты проводили в трех экземплярах. Планки погрешностей указывают на стандартное отклонение. Чтобы изучить снижение секреции вирусной РНК клетками Vero E6, вызванное GC373 и GC376, клетки инфицировали SARS-CoV-2 MOI = 0,01 БОЕ / клетку в присутствии различных концентраций GC373 или GC376 в течение 1 часа, среду удаляли и заменяли ростовой средой, также содержащей GC373 и GC376, и супернатанты собирали через 48 часов и количественно определяли с помощью количественной ОТ-ПЦР.

Количественное определение вирусной РНК SARS-CoV-2 в супернатантах клеточных культур с помощью qRT-PCR

Супернатанты клеток (140 мкл) собирали в различные моменты после заражения, и РНК выделяли с помощью мини-набора QIAmp Viral RNA Mini в соответствии с инструкциями производителя (Qiagen). Обратную транскрипцию проводили на 2 мкл с использованием мастер-микса Superscript IV Vilo (Invitrogen). Количественную ПЦР проводили с использованием 2 мкл кДНК в смеси TaqMan Fast Master с использованием праймеров и зонда для гена N (праймеры N2), разработанных центром США по контролю и профилактике заболеваний (IDT, кат. № 10006606).Стандартная кривая была построена с использованием разведений стандартов положительного контроля от CDC (IDT cat # 10006625).

Измерение цитотоксичности в клетках A549 и Vero E6

Жизнеспособность клеток измеряли с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (Promega). Либо клетки A549 (мужской эпителиальный эпителий легкого человека), либо клетки Vero E6 высевали по 5 × 10 3 клеток / лунку в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение ночи перед обработкой. Соединения GC373 и GC376 солюбилизировали в ДМСО и добавляли к клеткам в восьмиточечном четырехкратном серийном разведении (от 200 мкМ до 0.0122 мкМ). Клетки инкубировали в присутствии соединений в течение 24 часов перед добавлением субстрата люминесценции и измерением активности АТФ в соответствии с инструкциями производителя. Процент жизнеспособных клеток рассчитывали относительно клеток, обработанных одним растворителем (0,5% ДМСО). Результаты наносили на график как среднее значение трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение, где каждый эксперимент состоял из четырех повторностей лунок на концентрацию соединения.

Краткое изложение отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Резюме отчета об исследовании природы, связанном с этой статьей.

Владельцы собак и кошек с COVID-19 часто передают его домашним животным

Два новых неопубликованных исследования показывают, что люди с COVID-19 часто передают его своим собакам и кошкам, особенно если они делят постель со своими кошками, хотя у домашних животных обычно нет симптомов или они слабо выражены, но в некоторых случаях может иметь тяжелое заболевание.

Исследования будут представлены на виртуальном Европейском конгрессе клинической микробиологии и инфекционных заболеваний (ECCMID) с 9 по 12 июля.

Нет доказательств того, что домашние животные могут заразить людей

Согласно пресс-релизу ECCMID о первом исследовании, исследователи из Утрехтский университет в Нидерландах направил передвижную ветеринарную клинику в 196 домов владельцев собак и кошек, которые дали положительный результат на COVID-19 от 2 до 200 дней назад.Ветеринарный персонал взял мазки из носа, горла и прямой кишки у домашних животных для проверки на активную коронавирусную инфекцию, а также образцы крови для проверки на наличие антител, свидетельствующих о предыдущей инфекции.

Шесть из 154 кошек (3,9%) и 7 из 156 собак (4,5%) дали положительный результат на COVID-19, в то время как 31 кошка (20,1%) и 23 собаки (14,7%) имели антитела к коронавирусу. Все 11 домашних животных, которые прошли второй цикл тестов еще через 1-3 недели, дали положительный результат на антитела, а 3 кошки по-прежнему были положительными на COVID-19.У животных не было симптомов или они были легкими.

Ни одна из восьми кошек и собак, живущих в тех же домах, что и домашние животные, у которых был положительный результат теста на коронавирус, не заразилась, что позволяет предположить, что вирус не распространялся среди животных. Исследователи заявили, что предыдущие исследования показали, что COVID-19 чаще встречается у домашних животных инфицированных владельцев, чем у домашних животных, у которых нет такой точки контакта, с передачей от человека к животному, а не с передачей от животного к человеку.

Исследователи также заявили, что результаты показывают, что передача COVID-19 от человека к животному является обычным явлением.Ведущий автор исследования Эльс Броенс, доктор медицинских наук, доктор философии, сказала, что люди, у которых есть COVID-19, должны избегать контактов с домашними животными, а также с людьми.

«Однако основная проблема заключается не в здоровье животных — у них не было симптомов COVID-19 или у них были легкие симптомы, — а в потенциальном риске того, что домашние животные могут действовать как резервуар вируса и повторно занести его в человеческую популяцию», она сказала в выпуске.

«К счастью, на сегодняшний день о передаче вируса от животного человеку не сообщалось. Таким образом, несмотря на довольно высокую распространенность среди домашних животных из семей, инфицированных COVID-19 в этом исследовании, маловероятно, что домашние животные играют роль в пандемии.

Кошки, особенно восприимчивые к инфекции

Во втором выпуске новостей ECCMID подробно рассказывается об исследовании Университета Гвельфа в Канаде, которое включало тестирование 48 кошек и 54 собак из 77 выживших COVID-19 на антитела к коронавирусу. Владельцев спросили, как они взаимодействовали со своими питомцами, включая то, гладили ли они их или целовали, позволяли ли им сидеть у них на коленях, спать в своей постели, целовать или облизывать их лицо.

Исследователи также протестировали 75 собак и кошек в приюте для животных и 75 бездомных кошек прошли курс лечения от антител к коронавирусу в недорогой ветеринарной клинике.Тридцать две из 48 (67%) домашних кошек и 23 из 54 (43%) принадлежащих им собак имели антитела, по сравнению с 7 (9%) собаками и кошками в приюте для животных и 2 (3%) собаками из приюта для животных. бездомные коты.

Одиннадцать (20%) домашних собак имели симптомы, чаще всего вялость и потерю аппетита. У некоторых собак был легкий преходящий кашель или диарея. Тринадцать собственных кошек (27%) имели симптомы, чаще всего насморк и затрудненное дыхание. В то время как большинство случаев были легкими, три были тяжелыми.

Количество времени, проведенного собаками и владельцами вместе, а также тип контактов, которые они имели, не повлияли на вероятность заражения собак.Но это не относилось к кошкам, которые подвергались более высокому риску заражения коронавирусом, чем больше времени они проводили со своими хозяевами, особенно если они делили кровать.

Исследователи заявили, что у кошек есть биологические факторы, которые делают их более уязвимыми для COVID-19, чем собак, например, вирусные рецепторы, которые позволяют вирусу легче заражать клетки. Кошки также чаще, чем собаки, спят возле лица своего хозяина, что увеличивает их подверженность воздействию вируса.

Они добавили, что, поскольку уровень инфицирования у животных с владельцами был выше, чем у животных в приюте и бездомных кошек, люди с большей вероятностью передают вирус домашним животным, чем наоборот, что также показали предыдущие исследования.

Ведущий автор Дороти Бинцле, доктор медицинских наук, доктор философии, рекомендует инфицированным владельцам держаться подальше от своих домашних животных и не пускать их в спальню. «Я также рекомендую держать вашего питомца подальше от других людей и домашних животных», — сказала она в пресс-релизе.

«Хотя доказательства того, что домашние животные могут передавать вирус другим домашним животным, ограничены, их нельзя исключать», — добавила она. «Точно так же, хотя не было доказано, что домашние животные передают вирус обратно людям, эту возможность нельзя полностью исключать.«

Противовирусная активность итраконазола против коронавирусной инфекции кошек типа I. два разных биотипа: кишечный коронавирус кошек (FECV) и вирус инфекционного перитонита кошек (FIPV) [1]. Первый вызывает легкий энтерит (обычно субклиническую инфекцию), а второй — высоколетальное системное заболевание FIP.Несмотря на то, что противовирусные препараты и вакцины против FIP были исследованы, не было разработано ни одного метода для практического использования [2]. Кроме того, FCoV также существует в виде двух серотипов: FCoV типа I (FECV типа I и FIPV типа I) и FCoV типа II (FECV типа II и FIPV типа II) [3]. Серологические и генетические исследования показали, что FCoV типа I преобладает во всем мире [4,5,6].

Ранее мы сообщали, что FCoV типа I тесно связан с холестерином на протяжении всего жизненного цикла вируса [7]. Мы также продемонстрировали, что U18666A, ингибитор транспорта холестерина, сильно подавляет инфекцию FCoV I типа [8].Основываясь на этих выводах, U18666A может применяться в качестве терапевтического препарата для лечения FIP. Однако, насколько нам известно, U18666A не одобрен для практического использования в ветеринарии. Чтобы использовать U18666A для лечения FIP, необходимо провести фармакокинетические, фармакодинамические исследования и исследования безопасности кошек. Как и в случае с U18666A, было идентифицировано несколько противовирусных препаратов-кандидатов, нацеленных на FCoV типа I [9, 10]. Тем не менее, ни один из препаратов, научно продемонстрированных в отношении терапевтического действия на FIP, на практике не используется. Чтобы решить эти проблемы, желательно определить сильнодействующее противовирусное средство от инфекции FCoV среди лекарств, обычно используемых для кошек.

Итраконазол (ICZ) классифицируется как азольный противогрибковый препарат [11]. Он имеет низкую токсичность и может использоваться для лечения грибковых инфекций у пациентов с ослабленным иммунитетом [12]. Его обычно используют ветеринары для лечения грибковых инфекций у собак и кошек. Недавно было высказано предположение, что ICZ эффективен при энтеровирусных инфекциях (полиовирус, риновирус и вирус Коксаки) [13]. Ранее мы исследовали противовирусные эффекты ингибиторов транспорта холестерина, включая U18666A, и подтвердили, что ICZ ингибирует инфекцию FCoV I типа [8].Однако влияние ICZ на заражение FCoV подробно не исследовалось. В этом исследовании мы изучили противовирусные эффекты ICZ на FCoV.

Использовали клетки целого плода Felis catus (fcwf) -4, чувствительные к FIPV типа I, FIPV типа II и FECV типа II. ICZ (ITORIZOLE ® ) был приобретен у Janssen Pharmaceutical K.K. (Токио, Япония). В качестве растворителя ICZ 40% (мас. / Об.) Гидроксипропил-бета-циклодекстрина (FUJIFILM Wako Pure Chemical, Япония), содержащего 2,5% (об. / Об.) Пропиленгликоля и 0.Использовали 376% (об. / Об.) Соляную кислоту. ICZ доводили до 10 мМ с помощью растворителя, делили аликвоты и хранили при -30 ° C до использования. Поддерживающую среду (MEM) использовали для разбавления ICZ. Чтобы оценить цитотоксические эффекты ICZ и растворителя в клетках fcwf-4, жизнеспособность клеток измеряли с помощью анализа WST-8, как описано ранее [7]. Процент цитотоксичности рассчитывали по следующей формуле: Цитотоксичность (%) = 100 — [(OD клеток, обработанных ICZ (или растворителем) / OD клеток, не обработанных ICZ (или растворителем))] × 100. Конечный pH всех разбавителей ИЦЗ и растворителя — 7.5–7.6. Значения 50% цитотоксической концентрации (CC 50 ) и 10% цитотоксической концентрации (CC 10 ) ICZ составили 208,0 ± 22,9 (среднее ± стандартная ошибка) и 1,1 ± 0,4 (среднее ± стандартная ошибка), соответственно (Рисунок 1 ).

Рисунок 1

Цитотоксические эффекты ICZ в клетках fcwf-4. Жизнеспособность клеток fcwf-4 измеряли с помощью анализа WST-8, как описано ранее [7]. Черные кружки указывают на обработку ICZ, а белые кружки указывают на обработку растворителем (контроль растворителя).Концентрация растворителя была такой же, как в растворе ICZ при каждом серийном разведении. Данные представляют три независимых эксперимента.

Влияние ICZ на инфицирование 3 штаммов FCoV типа I (FIPV-I KU2, FIPV-I UCD1 и FIPV-I UCD4), 1 штамма FCoV типа II (FIPV-II WSU79-1146) в fcwf- Было исследовано 4 клетки. Конфлюэнтные монослои клеток fcwf-4 культивировали в среде, содержащей ICZ, в указанных концентрациях в 24-луночных многопланшетах при 37 ° C в течение 24 часов. Клетки промывали и вирус (MOI 0.01) адсорбировалась на клетках при 37 ° C в течение 1 ч. После промывания клетки культивировали в карбоксиметилцеллюлозе (CMC) -MEM или MEM без CMC. Чтобы выполнить анализ ингибирования бляшек с использованием 24-луночного пластикового планшета, необходимо четко подготовить бляшку на небольшой площади монослойных клеток, для которых CMC-MEM более подходит, чем агар-MEM для оверлейной среды. Для анализа ингибирования бляшек клетки, культивированные в CMC-MEM, инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов, фиксировали и окрашивали 1% раствором кристаллического фиолетового, содержащим 10% забуференный формалин, а затем подсчитывали полученные бляшки.Процент ингибирования бляшек рассчитывали по следующей формуле: Процент ингибирования бляшек (%) = 100 — [(число бляшек в клетках, обработанных соединением) / (число бляшек в клетках, не обработанных соединением)] × 100. Для клеток, культивированных в MEM, культуральные супернатанты собирали через 48 часов после инфицирования и титр вируса определяли титрованием. Предварительная обработка ICZ уменьшала образование бляшек FCoV типа I дозозависимым образом (рис. 2A). Образование бляшек FCoV типа I ингибировалось 0.03–20 мкМ ICZ. Напротив, процент ингибирования бляшек для FCoV типа II незначительно зависел от предварительной обработки ICZ. IC50 и SI (CC50 / IC50) ICZ для каждого вируса на основе результатов анализа ингибирования бляшек и анализа цитотоксичности показаны в таблице 1. Согласно анализу титрования, продукция FCoV типа I дозозависимо снижалась с помощью ICZ ( Рисунок 2B). Продукция FCoV типа II немного снизилась только при добавлении 20 мкМ ICZ. Затем мы исследовали экспрессию вирусных белков, чтобы дополнительно оценить влияние ICZ на инфекцию FCoV.Клетки Fcwf-4 выращивали на 8-луночных предметных стеклах Lab-Tek Chamber Slide (Thermo Fisher Scientific, США). Конфлюэнтные монослои клеток fcwf-4 культивировали в среде, содержащей 20 мкМ ICZ, при 37 ° C в течение 24 часов. Клетки промывали и вирус (MOI 0,01) адсорбировали в клетках при 37 ° C в течение 1 часа. После отмывки клетки культивировали в МЕМ. Монослои клеток инкубировали при 37 ° C. Через 72 часа уровни белка нуклеокапсида определяли с помощью иммунофлуоресцентного анализа (ИФА), как описано ранее [14]. Для распознавания белка FIPV N использовали mAb YN-2 (мышиный IgG2b), приготовленные в нашей лаборатории [15].Ядра окрашивали 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI; Dojindo Laboratories, ЯПОНИЯ). Уровни N-белка FIPV-I KU2 были специфически снижены в клетках fcwf-4, предварительно обработанных ICZ. В отличие от FIPV-I KU2, предварительная обработка ICZ не влияла на уровни N-белка FIPV-II 79-1146 в клетках fcwf-4 (рис. 2C).

Рисунок 2

Противовирусное действие ICZ на FIPV типа I и FIPV типа II. A Анализ ингибирования бляшек FCoV в клетках fcwf-4, обработанных ICZ.Черные полосы указывают на обработку ICZ, а белые полосы указывают на обработку растворителем (контроль растворителя). Результаты показаны как среднее значение ± стандартная ошибка. Данные представляют четыре независимых эксперимента. * p <0,05 о.с. контроль растворителя. B Ингибирование инфекции FCoV с помощью ICZ в клетках fcwf-4. Черные полосы указывают на обработку ICZ, а белые полосы указывают на обработку растворителем (контроль растворителя). Результаты показаны как среднее значение ± стандартная ошибка. Данные представляют четыре независимых эксперимента.* p <0,05 о.с. контроль растворителя. a: p = 0,054 о.с. контроль растворителя. b: p = 0,082 о.с. контроль растворителя. c: p = 0,052 о.с. контроль растворителя. C Влияние ICZ на экспрессию нуклеокапсида (N) FCoV. Белок FCoV N оценивали с помощью IFA. Данные представляют три независимых эксперимента. D Влияние постобработки на противовирусную активность ICZ. KU2: штамм FIPV-I KU2, UCD1: штамм FIPV-I UCD1, UCD4: штамм FIPV-I UCD4, 1146: штамм FIPV-II WSU 79-1146, ICZ: итраконазол.

Таблица 1 CC50, IC50 и SI итраконазола

Кроме того, мы исследовали влияние ICZ на образование бляшек после инфицирования клеток fcwf-4 FIPV-I KU2. Вирус с MOI 0,01 добавляли к культуре и адсорбировали клетками fcwf-4 при 37 ° C в течение 1 часа. После отмывки клетки культивировали в MEM при 37 ° C в течение 1 или 3 часов. После замены MEM на CMC-MEM, содержащую ICZ, клетки культивировали при 37 ° C в течение 48 часов. Процент ингибирования образования бляшек измеряли, как описано выше.Последующая обработка ICZ ингибировала образование бляшек FIPV-I KU2 до степени, сопоставимой с предварительной обработкой (рис. 2D). Напротив, процент ингибирования бляшек с помощью FIPV-II 79-1146 незначительно зависел от последующей обработки ICZ.

Инфекция FCoV типа I сильно ингибируется ингибитором транспорта холестерина U18666A [8]. Сообщалось, что ICZ ингибирует внутриклеточный транспорт холестерина, аналогично U18666A [16]. Поэтому мы оценили, подавляет ли ICZ внутриклеточный транспорт холестерина в клетках кошек.Содержание клеточного холестерина в клетках fcwf-4 оценивали с использованием набора для определения холестерина на основе клеток (Cayman chemical, США) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, клетки fcwf-4 выращивали на 8-луночных предметных стеклах Lab-Tek Chamber Slide (Thermo Fisher Scientific, США). Полуконфлюэнтные монослои клеток fcwf-4 культивировали в среде, содержащей 20 мкМ ICZ или 2 мкМ U18666A (FUJIFILM Wako Pure Chemical, Япония) при 37 ° C в течение 24 часов. После фиксации и окрашивания клетки, окрашенные филиппином III, анализировали с использованием микроскопа Leica DM4B и интегрированной системы визуализации LAS X (Leica Microsystems, Германия).ICZ индуцировал накопление клеточного холестерина, аналогично U18666A (рис. 3A). Чтобы определить, влияет ли ICZ на содержание клеточного холестерина, измеряли уровень холестерина в клетках fcwf-4. Количество внутриклеточного холестерина определяли с помощью набора Amplex Red Cholesterol Assay Kit (Molecular Probes, США) в соответствии с инструкциями производителя. Ни 2,5 мкМ, ни 20 мкМ ICZ не снижали уровни клеточного холестерина, как 2,0 мкМ U18666A (рис. 3В).

Рисунок 3

Влияние ICZ на накопление холестерина и клеточный уровень холестерина в клетках fcwf-4. A ICZ индуцировал накопление внутриклеточного холестерина. Содержание клеточного холестерина в клетках оценивали по окраске холестерин-филипин. Область в белом квадрате увеличивается в ячейке, обозначенной белой стрелкой. B Количественное определение клеточного холестерина в клетках fcwf-4. Данные представляют три независимых эксперимента.

Экспериментальное заражение домашних собак и кошек SARS-CoV-2: патогенез, передача и реакция на повторное заражение у кошек

Значение

SARS-CoV-2 — это развивающийся патоген, который уже имел катастрофические последствия для здоровья и благополучия -бытие людей во всем мире.Как зоонозный вирус, его последствия для популяций животных в значительной степени неизвестны. В этой рукописи описывается пилотное исследование, в котором домашних кошек и собак оценивали на их восприимчивость к инфекции. Хотя ни у одного из видов не развилось клиническое заболевание в этом исследовании, кошки передавали инфекционный вирус в течение 5 дней и заражали наивных кошек через прямой контакт, в то время как собаки, по-видимому, не выделяли вирус. У кошек, которые были повторно инфицированы SARS-CoV-2, возник эффективный иммунный ответ, и они не заразились повторно.Эти исследования имеют важное значение для здоровья животных и позволяют предположить, что кошки могут быть хорошей моделью для разработки вакцины.

Abstract

Пандемия, вызванная тяжелым острым респираторным синдромом коронавируса 2 (SARS-CoV-2), достигла почти каждой страны мира с необычайной передачей от человека к человеку. Наиболее вероятным исходным источником вируса был перенос из резервуара животных и последующая адаптация к человеку зимой 2019 года в провинции Ухань, Китай.Из-за своего генетического сходства с SARS-CoV-1 этот новый вирус, вероятно, имеет аналогичный диапазон хозяев и рецепторную специфичность. Из-за опасений по поводу передачи инфекции от человека к домашнему животному мы исследовали восприимчивость домашних кошек и собак к инфекции и возможность передачи инфицированных кошек наивным кошкам. Мы сообщаем, что кошки очень восприимчивы к инфекции, с длительным периодом выделения вируса через рот и нос, который не сопровождается клиническими признаками, и могут напрямую передаваться через контакт другим кошкам.Эти исследования подтверждают, что кошки восприимчивы к продуктивной инфекции SARS-CoV-2, но у них вряд ли разовьется клиническое заболевание. Кроме того, мы документируем, что у кошек развился устойчивый нейтрализующий ответ антител, который предотвращал повторное заражение после второй вирусной инфекции. И наоборот, мы обнаружили, что собаки не выделяют вирус после заражения, но имеют сероконверсию и вызывают реакцию нейтрализующих антивирусных антител. В настоящее время нет доказательств того, что кошки или собаки играют значительную роль в заражении человека; однако обратный зооноз возможен, если инфицированные владельцы подвергают своих домашних животных воздействию вируса во время острой инфекции.Устойчивость к повторному заражению дает надежду на то, что вакцинационная стратегия может защитить кошек и, соответственно, людей.

Пандемия коронавирусного заболевания (COVID-19), вызванная тяжелым острым респираторным синдромом, коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), возникла в китайской провинции Ухань в конце 2019 года и в течение 4 месяцев распространилась почти на все страны Китая. Мир. Анализ последовательности и эпидемиологические исследования предполагают, что вирус был животного происхождения, возможно, летучей мыши, и потенциально был впервые занесен в человеческую популяцию через промежуточного животного-хозяина на рынке морепродуктов Хуанань в Ухане, Китай (1, 2).Вирус быстро адаптировался к людям, и передача от человека к человеку стала почти непосредственным источником последующих инфекций, при этом непосредственный контакт и капли аэрозоля были основными путями заражения (3). Ранние признаки предполагали, что SARS-CoV-2, как и SARS-CoV-1, инфицирует клетки-хозяева путем связывания с ангиотензинпревращающим ферментом 2 (ACE2), рецептором, который экспрессируется у многих видов животных, хотя особенно не у мышей или крысы (4). Таким образом, хотя люди почти наверняка являются единственным источником инфекции для других людей, многочисленные ранние исследования показывают, что другие животные также восприимчивы к инфекции (5-7).

Первое сообщение об обратном зоонозе, или передаче от человека к животному, было получено из Гонконга, где собака пациента с COVID-19 многократно проверила ПЦР-положительный результат на SARS-CoV-2 (5). В последующие недели были зарегистрированы другие случаи заражения домашних животных в результате контакта с людьми, в том числе другая собака в Гонконге и кошка с клиническим заболеванием в Бельгии (6). Серологические исследования пока не смогли идентифицировать домашних собак и кошек как основной источник инфекции человека (8).Важно отметить, что опрос студентов-ветеринаров с подтвержденной инфекцией COVID-19 не смог выявить антитела против SARS-CoV-2 у их домашних животных (9). Несмотря на низкую вероятность передачи инфекции от животного к человеку или от человека к животному, по-прежнему важно уточнить, какую роль домашние животные играют в передаче SARS-CoV-2, если таковая имеется.

Первое опубликованное исследование экспериментальных инфекций у кошек показало, что кошки могут заразиться SARS-CoV-2 и потенциально передать вирус другим кошкам через аэрозоли, как было определено с помощью ПЦР-положительных образцов фекалий кошек в клетках в той же комнате, как и напрямую. зараженные кошки.В этом исследовании также описаны патология и смертность молодых кошек, умерщвленных через 3 и 7 дней после заражения (DPI) (7). В дополнительных сообщениях описывается распространение вируса и прямая контактная передача у кошек, а также сероконверсия у кошек, контактировавших с инфицированными людьми (10, 11). Описанные здесь эксперименты расширяют существующие работы, обеспечивая кинетику выделения у кошек с течением времени, оценивая нейтрализацию вируса, сероконверсию, оценивая патологию и исследуя передачу. Это первое сообщение о защитном иммунитете против SARS-CoV-2 у кошек после многократного воздействия.Эти исследования показывают, что кошки могут служить подходящей животной моделью для изучения инфекции SARS-CoV-2 и для дальнейшей разработки вакцин и терапевтических средств для использования как на животных, так и на людях. Мы также подтверждаем более раннее сообщение о том, что собаки не реплицируют вирус в верхних дыхательных путях (7), но документально подтверждают противовирусную нейтрализующую активность в сыворотке собак после контакта. Роль кошек в зоонозной передаче остается открытым вопросом, но относительно короткая продолжительность линьки и устойчивость к повторному заражению предполагает, что риск этого очень низок, особенно когда кошки содержатся в помещении и, таким образом, имеют ограниченный контакт с людьми или другими восприимчивыми животными.

Материалы и методы

Вирус.

Штамм вируса SARS-CoV-2 WA1 / 2020WY96 был получен от BEI Resources, дважды пассирован в клетках Vero E6 и заморожен при -80 ° C в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с 5% фетальной бычьей сывороткой и антибиотиками. Запас вируса титровали на клетках Vero E6 с использованием стандартного анализа двойного наложения бляшек (12), и бляшки подсчитывали через 72 часа после инфицирования для определения бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мл.

Животные.

Семь взрослых кошек (1 самец, 6 самок, возраст 5–8 лет) были получены из закрытой племенной колонии, содержащейся в Университете штата Колорадо в среде, свободной от патогенов, в Ассоциации по оценке и аккредитации лабораторных животных, аккредитованных Международной организацией по уходу за животными. средство.Скрининг кошек на антитела к кишечному коронавирусу был отрицательным перед переводом. Три собаки (суки в возрасте 5–6 лет) были получены от Ridglan Farms (Blue Mounds, WI). Кошки и собаки были переведены в Лабораторию болезней животных, учреждение уровня биобезопасности животных-3 в Университете штата Колорадо, где содержались группы, и их кормили сухой / влажной кормовой смесью с доступом к воде ad libitum. Животным давали возможность акклиматизироваться в течение нескольких дней, прежде чем были вставлены термочувствительные микрочипы (Lifechips, Destron-Fearing).c. в спине. Перед инокуляцией были получены исходный вес, температура тела, клиническая оценка и мазки из полости рта. В начале исследования все животные были явно здоровыми.

Virus Challenge.

Кошек вводили легкую анестезию 30–50 мг п / к. кетамина гидрохлорид (Зетамин), и собакам вводили успокоительное с помощью 1-3 мг ксилазина перед инокуляцией SARS-CoV-2 (день 0). Вирус, разведенный в фосфатно-солевом буфере (PBS), вводили обоим видам с помощью пипетки в ноздри (500 мкл / ноздри) до общего объема 1 мл; За животными наблюдали до тех пор, пока они полностью не оправились от анестезии.Обратное титрование вируса проводили на клетках E6 сразу после инокуляции, подтверждая, что кошки получали 3,0E5 БОЕ, а собаки получали 1,4E5 БОЕ.

Отбор проб.

Когорта кошек 1 (
n = 3).

Мазки из ротоглотки собирали на 1–5, 7, 10 и 14 DPI с помощью аппликатора для мазков с полиэфирным наконечником. Мазки помещали в среду BA-1 (MEM с трис-буфером, содержащую 1% бычьего сывороточного альбумина) с добавлением гентамицина, амфотерицина B и пенициллина / стрептомицина.Промывание носа проводилось на 1, 3, 5, 7, 10 и 14 DPI путем закапывания 1 мл BA-1 по каплям в носовые ходы бодрствующих или слегка анестезированных кошек и сбора выделений из носа в стерильную чашку Петри, позволяя промывной жидкости стечь. чихать или капать на блюдо. Кровь (5 мл в пробирки с сепаратором сыворотки) собирали перед инокуляцией и на 7, 14, 21, 28, 35 и 42 DPI. При 28 DPI кошек повторно инокулировали 3,0E5 БОЕ гомологичного вируса. Сбор образцов из носовой полости проводился через 1, 3, 5, 7, 10 и 14 дней после повторной инокуляции (дни 29, 31, 33, 35, 38 и 42 после первоначальной инокуляции), в это время кошек умерщвляли, а ткани собирали для гистопатологии. .

Когорта кошек 2 (
n = 4).

Двум из четырех кошек были подвергнуты легкому наркозу и заражены SARS-CoV-2, как для когорты 1. Через 48 часов после заражения в комнату с инфицированными кошками были помещены две наивные кошки и взяты образцы по тому же графику, что и раньше. . Две непосредственно зараженные кошки были умерщвлены на 5 DPI и следующие ткани были собраны для выделения вируса и гистопатологии: носовые раковины, трахея, пищевод, средостенный лимфатический узел, легкие, печень, селезенка, почки, тонкий кишечник, матка и обонятельная луковица.Ткани собирали в ВА-1, замороженном при -80 ° C, и гомогенизировали перед анализом бляшек. Дополнительные ткани, собранные для гистопатологии, включали сердце, толстую кишку, поджелудочную железу, долю полуподвалов и мезентериальные лимфатические узлы. Рентгенограммы грудной клетки были также получены у этих двух кошек до и непосредственно перед эвтаназией. Остальные две кошки были умерщвлены при 30 DPI и вскрыты; в дальнейшем эти кошки будут называться контактными кошками.

Собаки (
n = 3).

Собаки были отобраны с той же частотой и с использованием тех же методов, что и кошки в когорте 1, для 42 точек на дюйм.Собаки не подвергались повторному вызову.

Клинические наблюдения.

Температуру тела регистрировали ежедневно примерно в одно и то же время каждое утро на протяжении всего исследования с помощью тепловых микрочипов. Кошек и собак наблюдали дважды в день в течение первых 7 дней после заражения и, по крайней мере, один раз в день на протяжении всего исследования. Вес тела получали еженедельно. Рентгенограммы грудной клетки (3 изображения) были сделаны перед вызовом и при 5 DPI непосредственно перед эвтаназией для экспериментально инокулированных кошек в когорте 2 и просмотрены несколькими ветеринарами.Клиническая оценка включала в себя темперамент и оценку наличия любых клинических признаков заболевания, включая выделения из глаз, выделения из носа, птиализм, кашель / чихание, одышку, диарею, летаргию, анорексию, смерть. Ни у одного из животных не проявлялись клинические признаки заболевания, характеризующиеся каким-либо из этих симптомов, в любое время в течение исследования.

Анализ вирусов.

Выделение вируса было выполнено на всех образцах мазков из полости рта, носовых промывок и образцов ткани 5-DPI методом двойного наложения бляшек на клетках Vero E6, как описано ранее (12).Вкратце, 6-луночные планшеты с конфлюэнтными монослоями клеток промывали один раз PBS и инокулировали 100 мкл серийных 10-кратных разведений образцов, инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C и покрывали 0,5% агарозой в MEM, содержащей 2 % фетальной бычьей сыворотки и антибиотиков / противогрибковых средств. Второй оверлей с нейтральным красным красителем добавляли через 48 часов, а количество бляшек подсчитывали через 72 часа. Титры вирусов были зарегистрированы как log 10 БОЕ на мл.

Анализы нейтрализации уменьшения бляшек (PRNT) выполняли, как описано ранее (13).Сыворотку инактивировали нагреванием в течение 30 мин при 56 ° C, и двукратные разведения, приготовленные в ВА-1, начиная с разведения 1: 5, аликвотировали на 96-луночные планшеты. Равный объем вируса добавляли к разведениям сыворотки и инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C. После инкубации смеси сыворотка-вирус высевали на планшеты Vero E6, как описано для анализов выделения вируса. Титры антител регистрировались как величина, обратная наибольшему разведению, в котором было нейтрализовано> 90% вируса.

ELISA.

Образцы сыворотки кошек были инактивированы нагреванием и протестированы с помощью анализа налета, чтобы убедиться, что образцы неинфекционны, перед проведением анализа ELISA.Положительные контрольные антитела к рецептор-связывающему домену (RBD) и полноразмерному спайковому белку представляли собой человеческое mAb-антитело CR3022 (абсолютное антитело) и цельную молекулу человеческого IgG (Jackson Immuno Research). Положительным контролем для нуклеокапсидного ELISA служило кроличье моноклональное антитело к нуклеопротеину SARS-CoV (Sino Biological, Inc.). Отрицательный контроль представлял собой сыворотку человека реактивной степени чистоты (по сравнению с mAb CR3022). Не объединенные кошачьи сыворотки от двух конкретных свободных от патогенов, наивных экспериментальных животных и пяти биоархивированных образцов полевых изолятов, полученных до 2019 г., были использованы в качестве отрицательного контроля для валидации анализа (14, 15).Протоколы ELISA были адаптированы из протоколов ELISA для SARS-CoV-2, описанных Amanat et al. (16). На планшеты для ELISA (Thermo) наносили 2 мкг / мл спайкового гликопротеина RBD из SARS-CoV-2, рекомбинантного WuHan-Hu-1 из клеток HEK293T (BEI) или спайкового гликопротеина (стабилизированного) из SARS-CoV-2, Ухань. -Hu-1, рекомбинантный из бакуловируса (BEI). SARS-CoV-2 Spike RBB-His и эктодомен S1 + S2 спайк-белка 2019-nCoV (ECD) (Sino Biological) использовали на планшетах, используемых для тестирования серореактивности собак. Нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2 был подарком Брайана Гейсса (Университет штата Колорадо, Форт-Коллинз, Колорадо).Перед запуском экспериментальных кошачьих сывороток, анализ был оптимизирован с использованием положительных и отрицательных контрольных сывороток, описанных выше. Образцы и контроли разбавляли 1:50 в разбавителе для ELISA (1X PBS, твин, сухое молоко) и повторяли в двух экземплярах. Контрольные сыворотки человека были разработаны с использованием пероксидазы хрена (HRP) против человеческого IgG (Thermo), кошачьи сыворотки были разработаны с использованием антител против IgG кошек HRP (Thermo) или против IgM кошек (Novus Biologicals), сыворотки собак были разработаны с использованием анти- Собачий IgG HRP (Sigma) и кроличьи моноклональные антитела (mAb), нуклеокапсидный белок (NP) SARS-CoV детектировали с помощью антител против кроличьего IgG HRP (Thermo).Вторичные антитела разбавляли 1: 3000, и SigmaFast о-фенилендиамин дигидрохлорид (OPD) готовили в воде для инъекций и добавляли в лунки. Планшеты считывали при 490 нм с использованием спектрофотометра Multiskan Spectrum (Thermo Fisher). Среднее значение OD490 сыворотки отрицательного контроля плюс трехкратное стандартное отклонение показаний отрицательного контроля использовали для определения значений отсечки для каждого планшета.

qRT-PCR.

Бляшки были взяты из планшетов для культивирования от каждой кошки, чтобы подтвердить распространение вируса SARS-CoV-2.Экстракцию РНК проводили в соответствии с инструкциями производителя с использованием мини-наборов Qiagen QiaAmp Viral RNA. ОТ-ПЦР выполняли, как рекомендовано, с использованием последовательности зонда праймера E_Sarbeco, как описано Corman et al. (17), и системы одностадийной qRT-PCR SuperScript III Platinum (Invitrogen) со следующей модификацией; начальная обратная транскрипция была при 50 ° C. Стандартные кривые были получены путем серийного разведения исходной вирусной РНК из исходного изолята SARS-CoV-2 WA1 / 2020WY96.

Гистопатология.

Ткани кошек фиксировали в 10% забуференном формалине в течение 12 дней и переносили в 70% этанол перед разделением на гематоксилин и эозин (H&E). Слайды читал сертифицированный ветеринарный патолог.

Результаты

Клиническая болезнь.

Ни одна из кошек ни в одной из групп не показала каких-либо клинических признаков заболевания, и все они оставались афебрильными (температура <39,5 ° C) на протяжении всего исследования. Вес тела поддерживался с течением времени. Не было отмечено никаких признаков поражения легких или каких-либо других аномалий, определяемых рентгенологически (изображения не показаны).Точно так же собаки, вакцинированные SARS-CoV-2, оставались клинически нормальными и без лихорадки.

Выделение вирусов.

В когорте 1 все три кошки выделяли вирус как орально, так и назально до 5 DPI, при этом пиковые титры достигаются в результате выделения из носа на 3-й день. Назальные титры были примерно на 1 log выше, чем у пероральных мазков, взятых в то же время (рис. 1). В течение инфекции наблюдалась некоторая вариабельность титра, что, вероятно, связано со сбором образцов (т.е. количеством чиханий), но в целом данные демонстрируют явное присутствие инфекционного вируса как в полости носа, так и в ротоглотке в течение нескольких дней после заражения.В когорте 2 две непосредственно привитые кошки выделяли вирус на 5 DPI как орально, так и назально, с аналогичной картиной, что и в когорте 1. Однако контактные кошки передавали инфекционный вирус орально через 24 часа после воздействия, и продолжительность выделения была увеличена. по сравнению с привитыми кошками, с пиковым выделением через 7 дней после воздействия (рис. 1). Вирус был выделен из трахеи, носовых раковин и пищевода кошек в когорте 2, вскрытых на 5-й день. Инфекционный вирус не был обнаружен в легких или других органах кошек.Выделение вирусов не было обнаружено ни у одной из собак ни у одной из собак после инфицирования.

Рис. 1.

Инокуляция и заражение SARS-CoV-2 приводит к выделению из носа и ротоглотки у кошек. Вирус SARS-CoV-2 обнаруживается с помощью анализа бляшек из ( A ) носовых и ( B ) ротоглоточных секретов кошек с 1–5 DPI. Титры вирусов выражены как log 10 БОЕ / мл. Кошки 1, 2 и 3 представляют когорту 1. Кошки 4, 5, 6 и 7 представляют когорту 2. Кошки 4 и 5 были умерщвлены при 5 DPI.Кошек 6 и 7 вводили инфицированным кошкам в когорте 2 на 2 DPI.

Патология.

Грубых поражений не наблюдалось ни у одной из вскрытых кошек или собак. Гистологически у обеих кошек, умерщвленных при 5 DPI из когорты 2, умеренный язвенный гнойный лимфоплазмоцитарный ринит наблюдался в носовых раковинах наряду с легким лимфоплазмоцитарным трахеитом (рис. 2 A C ). У этих кошек также был минимальный альвеолярный гистиоцитоз с отеком. Обе кошки из когорты 2, которых вводили при 2 DPI и умерщвляли при 28 DPI, имели умеренный лимфоплазмоцитарный ринит с редкой фиброплазией.Все три кошки из когорты 1, умерщвленные 42 DPI, имели легкие изменения легкой степени, включая легкую интерстициальную лимфоцитарную пневмонию с перибронхиолярными и периваскулярными лимфоцитарными наручниками и альвеолярным гистиоцитозом (рис. 2 D ). У двух из этих кошек также был минимальный трахеит и легкий ринит, но в основном поражения в верхних дыхательных путях, по-видимому, уменьшились по сравнению с кошками на ранней временной точке, в то время как патология легких была более очевидной у этих животных по сравнению с теми, которых умертвили во время острой инфекции.

Рис. 2.

Воздействие SARS-CoV-2 приводит к острому воспалению верхних дыхательных путей и легким инфильтратам легких во время более поздних течений инфекции. ( A ) Кошка 4, когорта 2, трахея 5 DPI. Подслизистая основа расширена отеком (стрелки) и обильными воспалительными лимфоцитарными инфильтратами (звездочки), которые рассекают и разрушают подслизистые железы. Пятно H&E, увеличение 100 ×. ( B ) Категория 5, когорта 2, носовые раковины, 5 точек на дюйм. На срезе присутствует слизистая оболочка дыхательных путей нормальной толщины (открытая стрелка).Носовой респираторный эпителий варьируется от гиперпластического (черная стрелка с закрашиванием) до изъязвленного (острие стрелки). Подслизистая оболочка в областях изъязвления отечна и инфильтрована рассеянными нейтрофилами и мононуклеарными клетками. Пятно H&E, увеличение 40 ×. ( C ) Категория 5, когорта 2, носовые раковины, 5 точек на дюйм. Назальный респираторный эпителий варьируется от ослабленного (стрелка) до изъязвленного (острие стрелки) с вышележащими остатками клеточного мусора. Подслизистая оболочка (звездочка) в областях изъязвления отечна и инфильтрована рассеянными нейтрофилами и мононуклеарными клетками.Пятно H&E, увеличение 100 ×. ( D ) Кот 1, когорта 1, легкое, 42 DPI. Альвеолярные пространства («А») содержат разбросанные мононуклеарные клетки (стрелки). Стенка альвеол расширяется за счет смесей мононуклеарных клеток и случайных нейтрофилов (звездочка). Пятно H&E, увеличение 400 ×.

Сероконверсия.

Все животные были серонегативными в отношении SARS-CoV-2 на момент заражения (нейтрализация вируса <50% при разведении сыворотки 1:10). У кошек как в когорте 1, так и у кошек с прямым контактом развивалась нейтрализующая активность, измеренная с помощью PRNT, уже при 7 DPI.Титры нейтрализации у всех кошек достигали или превышали 1: 2,560 на 14 точек на дюйм и либо сохранялись, либо увеличивались в пределах от 28 до 42 точек на дюйм. У кошек, повторно посеянных при 28 DPI, наблюдалось умеренное увеличение титра PRNT в течение 14 дней после воздействия (таблица 1). Собаки вырабатывали нейтрализующие антитела при 14 DPI и достигали пика при 21 DPI с титрами от 1:40 до 1:80 (Таблица 1).

Таблица 1.

Титры антител (PRNT90) для кошек и собак, инфицированных SARS-CoV-2. NT, не тестировалось

Ответы антител

IgG, превышающие пороговые значения OD490, были обнаружены при 7 DPI как против полного спайкового гликопротеина, так и против RBD у всех экспериментально привитых кошек, а сероконверсия против NP была обнаружена в это время у 2 из 3 кошек.К 14 дню все пять кошек имели значения оптической плотности (OD), которые приближались к верхнему пределу обнаружения в спайковом ELISA; Насыщение RBD и NP OD было получено к 21 дню и не увеличивалось после повторного воздействия (фиг. 3 A ). Уровни сероконверсии и поглощения были одинаковыми между контактными кошками и экспериментально инфицированными кошками. Сероконверсия в спайковый белок была наиболее быстрой и устойчивой, а специфичность ответа на RBD превышала таковую у NP. Значения OD сероконверсии кошек для всех трех антигенов превышали оптическую плотность свободных от специфических патогенов (SPF) или полевых домашних кошек, а фон был самым высоким для NP.Антитела IgM против RBD были обнаружены на 7-й и 14-й день, но не на 28-й день. IgG-ответы были намного более устойчивыми, чем IgM (фиг. 3 B ). У собак произошла сероконверсия против RBD и спайковых антигенов, начиная с 14 дня, но значения OD были значительно ниже, чем у кошек, и менялись со временем (фиг. 3 C ).

Рис. 3.

Кошки и собаки, инфицированные SARS-CoV-2, быстро вырабатывают антитела против вирусных антигенов. ( A ) Сыворотка кошек с интраназальной инокуляцией SARS-CoV-2 ( n = 3, ‘EI’) или подвергшихся вакцинации кошек ( n = 2, ‘C’) оценивалась на серореактивность к RBD. , Spike или NP на 30–42 дня после воздействия.Реактивность IgG к Spike и RBD была очевидна на 7-й день, и все животные явно имели сероконверсию на 14-й день. ( B ) IgM против RBD временно обнаруживался на низких уровнях по сравнению с IgG на 7-й и 14-й дни после воздействия у кошек (экспериментально инокулированные животные, n = 3). Столбцы представляют собой 1 SE среднего. Собаки, инфицированные сероконверсией SARS-CoV-2, по сравнению с антигеном Spike и RBD с более низкой реактивностью, чем кошки (C ). Тестирование сыворотки в указанные дни. Реактивность IgG была очевидна к 14 дню, но стабилизировалась и / или уменьшилась к 42 дню.Пунктирными линиями указаны пороговые значения для серопозитивного диагноза. Цвета соответствуют RBD (красный), Spike (синий) или Nucleocapsid (зеленый) ELISA.

Реинфекция.

Повторно зараженных кошек в когорте 1 брали пробы на оральное и назальное выделение в течение 7 дней после воздействия путем выделения вируса, и выделение не было обнаружено с помощью анализа бляшек ни у одной кошки в любой момент времени после повторного заражения.

Обсуждение

Пандемия COVID-19 затронула практически все страны мира и является самой значительной вспышкой нового зоонозного патогена в текущем столетии.Вирус SARS-CoV-2 является одним из трех новых зоонозных коронавирусов, способных вызывать серьезные заболевания у людей за последние два десятилетия, после SARS-CoV-1 и коронавируса ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV) (18). Общая тенденция возникновения болезней способствует передаче вируса от животных к человеку, а землепользование и вторжение в дикую природу — лишь два фактора, способствующих этому явлению (19). Сохранение рынков живых животных обеспечивает оптимальные условия для возникновения зоонозов (20).Как и SARS-CoV-1 и MERS-CoV, SARS-CoV-2, вероятно, имеет происхождение от летучих мышей на основании филогенетического анализа (2), но в отличие от своих предшественников SARS-CoV-2 быстро эволюционировал для высокоэффективной передачи вируса от человека к человеку. передача от человека (21). В то время как животные, в том числе домашние животные и домашние животные, часто считаются источником новых патогенов, обратный зооноз SARS-CoV-2 более вероятен, поскольку случаи заболевания людей гораздо более распространены, чем домашние животные, и на сегодняшний день нет доказательств заражения. кошки или собаки, передающие SARS-CoV-2 человеку.Аналогичные результаты были получены с SARS-CoV-1, когда домашние кошки, подвергшиеся воздействию вируса от инфицированных людей, заражались, а кошки, экспериментально инфицированные, выделяли вирус в течение нескольких дней (22, 23). Было зарегистрировано несколько случаев заражения домашних животных SARS-CoV-2 после контакта с инфицированными людьми в Нью-Йорке, Гонконге, Бельгии, Германии, Испании, Франции и России (5, 24–29). Другие воздействия на животных от инфицированных людей включают выращенных на фермах норок, у которых проявляются респираторные симптомы, желудочно-кишечные симптомы и даже внезапная смерть после заражения (30).В некоторых из этих случаев, включая домашних кошек в зоопарке Бронкса и домашних кошек в Нью-Йорке и Европе, животные проявляли признаки респираторного заболевания и / или конъюнктивита. Ни одна из кошек или собак в этом исследовании не показала каких-либо клинических признаков заболевания, но индивидуальный статус здоровья животного, возраст и сопутствующие заболевания могут быть ответственны за эту изменчивость. Два других исследования по оценке экспериментальной инфекции у кошек сообщили об изменении респираторных признаков; Таким образом, необходимы дальнейшие исследования клинических проявлений заболевания у кошек (7, 10).Патологические изменения у кошек позволяют предположить, что у здоровых животных может развиться субклиническая форма заболевания. Это не совсем отличается от инфекций человека, где большинство случаев относительно легкие, но более тяжелое заболевание, как правило, встречается у пожилых пациентов со значительными сопутствующими заболеваниями (31). В недавнем серологическом обследовании кошек в Ухане, Китай, около 14,7% отобранных животных оказались серопозитивными на SARS-CoV-2 по данным RBD ELISA, что позволяет предположить, что популяция кошек в районах с высокой степенью передачи вируса от человека также может быть подвержена воздействию вируса ( 11).Принимая во внимание, что число случаев инфицирования людей достигло миллионов, и все же лишь несколько животных дали положительный результат ПЦР, маловероятно, что домашние животные являются значительным источником инфекции или подвержены серьезному риску развития тяжелого заболевания. Важно отметить, что зараженные кошки линяют в течение не более 5 дней после контакта, что свидетельствует о том, что кошки при контакте с инфицированными людьми быстро разовьются и избавятся от инфекции. Для сравнения, у людей обычно инкубационный период составляет ~ 5 дней, и они могут выделять вирус более 3 недель (32, 33).Таким образом, если люди с симптомами следуют соответствующим процедурам карантина и остаются дома со своими домашними животными, риск заражения потенциально зараженной кошкой другого человека минимален. Зараженным домашним кошкам нельзя позволять свободно гулять на открытом воздухе, чтобы предотвратить потенциальный риск распространения инфекции на других уличных кошек или диких животных. Необходимы дополнительные исследования восприимчивости видов диких животных и потенциала распространения инфекции в популяциях кошек на открытом воздухе для выявления факторов риска и стратегий смягчения последствий для предотвращения создания резервуарных инфекций у диких кошек или других диких животных.

Разработка моделей животных для изучения SARS-CoV-2 является важным шагом в методологии исследования. Макаки-резусы, хомяки и хорьки являются подходящими моделями для воспроизведения бессимптомного или умеренно клинического заболевания, и хотя эта работа не часто используется в качестве традиционной модели на животных, эта работа демонстрирует, что кошки могут служить альтернативной моделью (34–36). У кошек в этом исследовании развились субклинические патологические изменения в верхних дыхательных путях на ранней стадии инфекции, а патология нижних дыхательных путей — позже, после удаления вируса. полезность в качестве животной модели, более актуальной для легких заболеваний человека.Кроме того, относительно высокий титр вирусного выделения, производимый кошками, и скорость передачи могут сделать их идеальной моделью для моделирования аэрозолей. Таким образом, модели кошек могут быть весьма полезными для понимания кинетики выделения / распространения SARS-CoV-2. Возможно, наиболее важно то, что у кошек вырабатываются значительные титры нейтрализующих антител, и они устойчивы к повторному заражению, хотя продолжительность иммунитета в настоящее время неизвестна. Это может оказаться полезным измерением для последующих испытаний вакцин-кандидатов как для людей, так и для животных.

Доступность данных.

Все данные исследования включены в статью SI и приложение .

Благодарности

Мы благодарим Тодда Басса и гистологическую лабораторию Университета штата Колорадо за подготовку тканевых кассет и слайдов для гистопатологии, а также доктора Брайана Гейсса за предоставление нуклеокапсидного белка SARS-CoV-2. Эта работа финансировалась Фондом моделей животных Университета штата Колорадо. Изолят коронавируса 2, связанного с атипичной пневмонией, USA-WA1 / 2020 (NR-52281) был депонирован Центрами по контролю и профилактике заболеваний и получен через BEI Resources, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID), NIH.Следующие реагенты были произведены под HHSN272201400008C и получены через BEI Resources, NIAID, NIH: Spike Glycoprotein RBD из SARS-Related Coronavirus 2, Wuhan-Hu-1, Рекомбинантный из клеток HEK293, NR-52306 и Spike Glycoprotein (Stabilized) из SARS. -Родственный коронавирус 2, Wuhan-Hu-1, рекомбинантный из бакуловируса, NR-52396.

Сноски

  • Вклад авторов: A.M.B.-L., A.E.H., S.M.P. и R.A.B. спланированное исследование; A.M.B.-L., A.E.H., S.M.P., P.W.G., A.D.B. и R.A.B. проведенное исследование; П.У.Г., М.Н. и С.В. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; A.M.B.-L., A.E.H., S.M.P., M.N., A.D.B., I.K.R. и R.M.M. проанализированные данные; и A.M.B.-L. и С.В. написал газету.

  • Авторы заявляют об отсутствии конкурирующей заинтересованности.

  • Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

Странная история о ремдесивире и лекарстве для кошек с черного рынка

Когда в прошлом году два котенка Робин Кинц, Фиона и Генри, заразились смертельной кошачьей болезнью, она начала слышать о лекарстве, продаваемом на черном рынке из Китая.Использование препарата, известного как GS-441524, основано на законных исследованиях Калифорнийского университета в Дэвисе, но способы его получения казались гораздо менее обоснованными. «Это было так:« Если вы хотите спасти свою кошку, пришлите мне тысячи долларов, и я отправлю вам несколько флаконов без опознавательных знаков », — говорит она. И она это сделала. Кинц перевела тысячи долларов, получила флаконы без опознавательных знаков из Китая, а затем вводила прозрачную жидкость своим умирающим кошкам каждый день в течение нескольких месяцев.

Первое, что примечательно, учитывая характер сделки, — это то, что, по словам Кинца, флаконы действительно сработали.Генри прожил еще почти год, и Фиона полностью выздоровела. Она все еще носится сегодня, пушистая и живая — чудо, учитывая, что ветеринары долгое время считали ее болезнь, кошачий инфекционный перитонит, неизлечимой и смертельной на 100 процентов. Сейчас Кинц управляет группой в Facebook, в которую входят 22 000 человек, которые помогают владельцам кошек пользоваться GS-441524. Сообщается, что тысячи кошек были излечены от FIP.

Прочтите: Почему коронавирус так сбивает с толку

Вторая примечательная вещь заключается в том, что GS-441524 почти идентичен широко обсуждаемому человеческому препарату: ремдесивиру, противовирусному препарату, который в настоящее время наша лучшая надежда на лечение COVID-19, болезни, вызванной новым коронавирусом.Хотя ранние данные предполагают, что препарат в лучшем случае сокращает время восстановления, Энтони Фаучи рекламировал ремдесивир из Белого дома. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов разрешило использовать его в экстренных случаях. А Gilead Sciences, компания, которая производит ремдесивир, жертвует 1,5 миллиона доз препарата на фоне пандемии.

Генри (L) и Фиона (R) обрабатывали GS-441524. Генри умер в начале этого года, но Фиона все еще жива, что ее владелец Робин Кинц приписывает наркотику. (С любезного разрешения Робина Кинца)

Компания Gilead также изобрела и запатентовала GS-441524.Его ученые являются соавторами исследований Калифорнийского университета в Дэвисе, показывающих эффективность против FIP. Но компания отказалась лицензировать GS-441524 для использования на животных из опасения, что его сходство с ремдесивиром может помешать процессу одобрения FDA препарата для людей, первоначально предназначенного для лечения Эболы. Когда это не удалось и позже возникла глобальная пандемия нового коронавируса, компания начала тестировать его на COVID-19. Ремдесивир имеет небольшую, но продуманную модификацию, которая улучшает его проникновение в клетки, но он и GS-441524 действуют точно так же, подавляя вирусы.

FIP также вызван коронавирусом — не тем, который вызывает COVID-19, а специализируется на заражении кошек. (Хотя люди могут передавать COVID-19 кошкам в редких случаях, люди не могут заразиться от кошек FIP.) У большинства кошек этот кошачий коронавирус, или FCoV, вызывает легкую диарею или вообще не вызывает никаких симптомов. Но в небольшом меньшинстве случаев вирус поражает белые кровяные тельца, и иммунная система сходит с ума до полномасштабного FIP. Заболевание бывает двух форм, причем обе являются смертельными: влажная, при которой грудь или живот кошки набухает от жидкости, и сухая, при которой жидкости нет, но кошка все еще лихорадит и болеет.В конце концов, он умирает. На протяжении десятилетий ветеринарам нечего было предложить, кроме эвтаназии.

Потом появился GS-441524. Небольшие испытания в Калифорнийском университете в Дэвисе, опубликованные в 2018 и 2019 годах, показали, что жизнь кошек не просто продлевается на несколько дней или недель, но, по-видимому, вылечена. «Это действительно изменило правила игры», — говорит Дрю Вейгер, ветеринар и президент Winn Feline Foundation, который финансировал некоторые исследования Калифорнийского университета в Дэвисе. «Три года назад мы говорили пациентам:« Ваша кошка умрет ». Теперь мы можем сказать им кое-что еще.Это настоящая история.


История препарата, впервые испытанного против лихорадки Эбола (который потерпел неудачу), близкий родственник которого стал новаторским средством лечения кошачьей болезни (но только незаконно), и который был возрожден в пандемии совершенно нового вируса, подчеркивает причуды разработки лекарств. Для ясности: пока ремдесивир проходит клинические испытания, GS-441524 не тестировался на людях на предмет безопасности или эффективности против COVID-19. Препараты GS-441524 на черном рынке также невероятно дороги.12-недельный курс лечения кошек может стоить более 10 000 долларов в зависимости от марки, типа FIP и веса кошки. Кроме того, нет законного способа купить GS-441524 в качестве лекарства — ни для кошек, ни для людей.

Препарат, вероятно, никогда не тестировался бы на кошках, если бы не тот факт, что Нильс Педерсен, давний исследователь FIP в Калифорнийском университете в Дэвисе, лично знал бывшего главного научного директора Gilead. Они познакомились 30 лет назад, когда компания Gilead тестировала противовирусные препараты против ВИЧ на обезьянах, а Педерсен работал в исследовательском центре приматов.Но настоящей любовью Педерсена всегда были кошки. Он вырос в их окружении на птицефабрике. Его коллега с любовью предупредил меня, что Педерсен «вспыльчив» и с ним трудно дозвониться. Но его голос смягчился, когда он заговорил об укрощении этих амбарных кошек и поиске домов для их котят.

Педерсен увлекся FIP в ветеринарной школе в 1960-х годах, когда это все еще оставалось загадочной болезнью с загадочной причиной. Спустя десятилетия ученые обнаружат кошачий коронавирус, лежащий в основе FIP, а затем потратят годы на попытки, но безуспешно, разработать рабочую вакцину.В итоге Педерсен посвятил свою карьеру болезни. А когда вакцины не помогли, он начал думать о противовирусных препаратах, и он снова стал думать о Gilead. Калифорнийская компания специализируется на разработке противовирусных препаратов, в том числе Тамифлю, Трувада и ряда лекарств от ВИЧ и гепатита С.

Около пяти лет назад Педерсен связался со своим представителем в Gilead, и компания отправила ему 25 или 30 молекул, взятых из большой библиотеки кандидатов в лекарства, которую обычно поддерживают фармацевтические компании.Две молекулы чудесным образом работали в клетках кошек, инфицированных вирусом FIP: GS-441524 и GS-5734, последний из которых теперь более известен как ремдесивир.

Прочтите: Почему одни люди болеют хуже других

И GS-441524, и ремдесивир работают, блокируя репликацию вируса. Они являются аналогами нуклеозидов, то есть имитируют строительные блоки нуклеозидов — A, U, C или G, которые составляют генетический материал вируса. В частности, они имитируют «А», и когда вирус обманом заставляют включить молекулу GS-441524 или ремдесивира вместо «А», процесс репликации затрудняется.В конце концов, буквы больше не могут быть добавлены, и вирус не может реплицироваться. Между двумя препаратами разница заключается в том, что ремдесивир имеет дополнительную фосфатную группу, небольшое изменение, которое помогает ему проникать в клетку и использоваться в репликации. Эта модификация обычно используется для повышения эффективности аналогичных противовирусных препаратов. «Это одна из тех действительно умных вещей, которые отлично сработали», — говорит Кэтрин Сели-Радтке, исследователь антивирусной защиты из Университета Мэриленда, округ Балтимор.

Однако по какой-то причине эта модификация не оказала большого влияния на клетки кошек, инфицированные вирусом FIP.Обе молекулы были эффективны, поэтому Педерсен решил заняться более простой, GS-441524. Затем он заразил 10 кошек FIP и ввел им дозу GS-441524. Все 10 кошек выздоровели.

«Мы чуть не упали со стульев», — говорит Вайгер. Это смешно, , — подумал он. Это не может так хорошо работать. Подожди, подожди, остановись, вернись? Что он сделал? Первоначальное исследование было небольшим и проводилось в искусственных условиях, но в последующем полевом испытании 31 домашнее животное с естественно приобретенным FIP 25 в конечном итоге его удалось — неслыханная скорость выздоровления.Педерсен ранее тестировал другой противовирусный препарат из Университета штата Канзас, но только у семи из 20 кошек наступила ремиссия. В то время эти результаты казались впечатляющими, но GS-441524 оказался еще лучше.

Педерсену сейчас 76 лет, и он посвятил 50 лет своей карьеры исследованиям ФИП. Наконец, казалось, лекарство было под рукой. «Я чувствовал себя очень хорошо, — сказал он мне, — и я подумал, что это хорошая точка зрения на мою карьеру». Но замковый камень так и не материализовался, по крайней мере, не так, как он ожидал.Несмотря на успех, компания Gilead отказалась лицензировать GS-441524 для использования на кошках.


Пока Педерсен тестировал GS-441524 на кошках, другой вирус — вирус человека — бушевал на полмира в Западной Африке: Эбола. Вирус, вызывающий Эбола, не является коронавирусом, но ремдесивир необычайно широко действует для противовирусного препарата, и первые результаты в борьбе с Эболой были многообещающими. Настолько многообещающе, что компания ожидала одобрения FDA ремдесивира для людей.

По словам Педерсена, Gilead обеспокоена тем, что исследование кошек может помешать процессу утверждения ремдесивира.Поскольку GS-441524 и ремдесивир очень похожи, о любых побочных эффектах, обнаруженных у кошек, возможно, придется сообщать и исследовать, чтобы гарантировать безопасность ремдесивира для людей. Предостережение Gilead относительно создания ненужных данных о кошках является стандартной отраслевой практикой. «Одно из правил при разработке лекарств — никогда не проводить тест, в котором нет необходимости, если результаты могут быть проблематичными», — говорит Ричард Саклебен, исследователь фармацевтической промышленности на пенсии. (Компания Gilead отказалась комментировать эту историю.)

Педерсену было трудно принять это объяснение.«Это был удар», — сказал он. «Это очень сильно бьет по тебе, особенно когда ты не видишь для этого никаких причин». Он, как и академические исследователи, все еще публиковал исследования, и результаты стали известны в 2018 и 2019 годах.

Джереми Сэмюэл Фауст: Нехватка лекарств — следующий кризис

Вскоре после этого Педерсен начал получать известия от людей в Китае. Одна компания хотела лицензировать препарат у Gilead, сказал он мне, и попросила Педерсена выступить в роли посредника. Компании не удалось получить лицензию, но она все равно начала продавать препарат от ФИП, и его точная формула неясна.Другие компании явно рекламируют свои составы как GS-441524. Китай имеет большую базу фармацевтического производства, и сырой GS-441524 синтезировать не представляет особой сложности. FIP также представляет собой растущую проблему в стране, поскольку кошки — особенно чистокровные кошки, которые более подвержены заболеванию — становятся все более популярными в Китае. Возник черный рынок, чтобы заполнить вакуум, оставленный Gilead.

Использование лекарств из Китая сначала вызывало споры в сообществе FIP. «Я получил за это много писем с ненавистью.Я потерял много сторонников », — говорит Питер Коэн, один из первых сторонников наркотиков. Коэн управляет ZenByCat, некоммерческой организацией, которая собирает деньги для двух групп, финансирующих исследования FIP, SOCK FIP и фонда Bria для исследований FIP Фонда Винна Фелайна. Более ранние итерации групп поддержки Facebook, таких как FIP Fighters, также изначально запрещали любое обсуждение наркотиков на черном рынке.

Сьюзан Гингрич, бывшая администратор этой группы в Facebook, сосредоточилась на оказании давления на Gilead. Гингрич, чей брат — бывший спикер Палаты представителей Ньют Гингрич, также является основателем Bria Fund.Ее кошка Брия умерла от FIP в 2005 году, и в том же году она основала фонд на пожертвования своего брата, себя и своего мужа. «Было бы намного проще, если бы Gilead либо продавала его, либо позволяла продавать его другому предприятию», — говорит она. Гингрич купил акции Gilead после того, как раннее исследование GS-441524 показалось многообещающим. В июне 2019 года она написала письмо в Gilead, а также президенту Дональду Трампу, ее конгрессмену и сенаторам в Теннесси, умоляя компанию разрешить использование этого препарата животным.Она говорит, что не получила ответа.


Когда Кинц пытался спасти Фиону и Генри, она спросила о GS-441524 в одной из тех групп Facebook, которые запретили обсуждение этого препарата. Ее пост в группе никуда не пошел, но две женщины в частном порядке писали ей советы. В итоге Кинц основал новую группу, которая теперь называется FIP Warriors, чтобы они могли обмениваться советами и отзывами о различных брендах. Группа выросла до 22 000 участников на Facebook, а также 25 администраторов и 26 модераторов. У него есть спутниковые группы в разных странах и на разных языках по всему миру.«Иногда кажется, что это глобальная корпорация», — говорит Кинц, консультант по дизайну в северной части штата Нью-Йорк, когда она не руководит группой в Facebook. Если она собирается быть офлайн, скажем, на шесть часов, она уведомляет других администраторов и модераторов. Группа в Facebook превратилась в международную организацию, работающую круглосуточно и без выходных.

FIP Warriors также имеет сеть групповых чатов в чрезвычайных ситуациях для каждого штата. Поскольку доставка из Китая может занять много времени и чем раньше начнется лечение GS-441524, тем лучше, экстренные чаты соединяют новых участников с теми, у кого есть дополнительные флаконы GS-441524.

Зина Лемеш, юрист и заводчик кошек из Нью-Йорка, присоединилась к группе в феврале, когда ее кошка Нора заболела желтухой и перестала есть, а ее живот распух, как шар для боулинга. Лемеш узнала признаки влажного ФИП и знала, что это безнадежная болезнь. Она собиралась позвонить своему ветеринару по поводу эвтанзии, когда наткнулась на группу в безумных онлайн-поисках лечения. Она разместила призыв к экстренной помощи для GS-441524. «В течение 10 минут я связалась с кем-то», — сказала она мне.«В течение следующих двух часов моей кошке уже сделали прививки». И через пару дней Нора снова начала есть. Она почти закончила свой 84-дневный режим. Ее раздутый живот полностью исчез.

«Это мама-кошка и адвокат говорят одновременно, и я пытаюсь уравновесить их в своем мозгу, а это сложно», — сказал Лемеш. С одной стороны, мама-кошка, которая пошла на все, чтобы спасти свою кошку; с другой — юрист, придерживающийся правил, который не может поверить, что она ввела своей кошке немаркированные наркотики от незнакомца.Но если это между тем, чтобы позволить Норе умереть, и небольшим шансом спасти ее, выбор был очевиден. Конечно, Лемеш сказала мне, что она предпочла бы пойти законным путем — если бы это был вариант. «Как вы думаете, люди хотели бы отправить от 7000 до 12000 долларов в какой-то странный источник?» она сказала. «Или они предпочтут заплатить своему ветеринару?»

Доступность GS-441524 на черном рынке ставит ветеринаров в тупик. Они не могут прописать препарат или законно купить его владельцам кошек. Некоторые соглашаются помочь хозяевам делать уколы, которые могут быть трудными и болезненными для кошки.Но другие не хотят иметь ничего общего с неодобренным препаратом. Линда Пендерграсс-Нетери, которая живет в Чаттануге, штат Теннесси, сказала мне, что в конечном итоге она сменила ветеринара. По ее словам, ее первый ветеринар отказался помочь. Второй прописал ей седативный габапентин, чтобы смягчить ее кошку Сандэнс для инъекций. Поэтому каждый день, за пару часов до ежедневной инъекции Сандэнса, Пендерграсс-Нетери и ее муж дают ему дозу габапентина. Когда приходит время, они закапывают его в белое полотенце — «как мумию», — сказала она, — и вводят ему GS-441524.Это определенно работа для двух человек.

Между тем, компания FIP Warriors стала достаточно заметной, и теперь китайские продавцы обращаются к группе, чтобы продать свой GS-441524. Кажется, они появляются, а затем исчезают. «Трудно сказать, являются ли они компаниями или своего рода бэкдор-дилерами», — говорит Кинц. Но группа попыталась ввести небольшую степень ответственности. В какой-то момент компания провела тестирование нескольких популярных брендов, чтобы проверить концентрацию и содержимое их флаконов GS-441524. Когда приближаются новые продавцы, группа просит образцы для отправки в службу спасения кошек, которая, возможно, не сможет позволить себе GS-441524 для котят, которые в противном случае наверняка умерли бы от FIP.«Обычно так мы определяем, работает ли это и будет ли все в порядке», — говорит Кинц. Но группа также изобилует заявлениями о невозможности проверки какого-либо конкретного препарата.

Показательный пример: в январе этого года появилась популярная марка GS-441524 для уничтожения кошек, которым вводили препарат. Когда группа начала замечать закономерность, администраторы начали собирать данные и предупреждать о самой последней партии бренда. Мужчина, продававший его в Интернете, исчез, а несколько членов группы заявили, что он все еще должен им деньги.Ходили слухи, что он и его жена яростно развелись; она была мозгом операции, и он пытался, но не смог продолжить бизнес. Затем появилась новая марка GS-441524, предположительно сделанная его женой. Невозможно проверить на расстоянии половины земного шара. «Это действительно похоже на Дикий Запад», — говорит Кинц.

Недавний всплеск интереса к ремдесивиру может частично изменить эту динамику. После того, как испытания Эболы не показали особой пользы, ремдесивир стал лекарством от болезни (человека).